間接測定卵白磷酸化的一種典范方式是將全部細胞與噴射性標記的32P-磷酸鹽配合孵育，取得細胞提取物，經由進程SDS-PAGE分手，并暴光在膠片上。這類煩瑣的方式須要屢次幾小時的孵育，且操縱噴射性同位素。其余傳統方式包羅2D凝膠電泳，這類手藝假設磷酸化會轉變卵白的遷徙率和等電點。

　　鑒于這些方式很吃力，磷酸化依靠抗體的開辟遭到研討職員的極大接待。1981年，第一個有記實的磷酸化抗體在兔子中產生，操縱的是鑰孔蟲戚血藍卵白(KLH)的苯甲酰磷酸連系物。這一抗體普遍地辨認了包羅磷酸酪氨酸的卵白。十年后，操縱分解的磷酸化肽段來免疫兔子，開辟出多個磷酸化狀況特異抗體，這些磷酸化肽段代表了方針卵白磷酸化位點四周的氨基酸序列。以后將免疫血清上樣到肽段親和柱中，產生高度特異的免疫試劑。磷酸化特異抗體的呈現為傳統方式的改良和新的免疫闡發手藝的開辟翻開了大門。在任何手藝中操縱磷酸化特異抗體的忠言是，勝利的檢測依靠于抗體與方針磷酸化卵白的特同性和親和力。

　　Western Blot

　　Western blot是評價卵白磷酸化狀況的最常常操縱方式，大局部細胞生物學嘗試室都具備展開這些嘗試的裝備。操縱SDS-PAGE分手生物樣品，隨后轉移到膜上(凡是是PVDF或尼龍膜)，以后操縱磷酸化特異的抗體來判定方針卵白。典范的Western blot嘗試步驟防止了操縱噴射性同位素時的風險品和廢料處置請求。很多磷酸化特異抗體非常活絡，可輕松檢測慣例樣品(如10-30 µg細胞提取物)中的磷酸化卵白。因為測得的磷酸化卵白程度可以或許到處置或凝膠上樣偏差而變更，研討職員常常操縱一個抗體來檢測同源卵白的總程度(而不斟酌磷酸化狀況)，以肯定磷酸化組分絕對總組分的比例，并充任上樣內對比。化學發光和顯色法都很常常操縱，而份子量marker常常操縱來供給卵白份子量的信息。

　　酶聯免疫吸附闡發(ELISA)

　　ELISA已逐步成為測定卵白磷酸化的一種無力方式。ELISA的定量能力優于Western blot，且在調理激酶活性和功效的研討中表現出龐大的感化。這類微孔板情勢的闡發普通操縱方針卵白特異的捕獲抗體，與磷酸化狀況有關。隨后讓方針卵白連系在抗體包被的闡發板中，方針卵白可以或許是純的，也可以或許是龐雜的異質樣品(如細胞裂解液)中的一個組分。插手待闡發的磷酸化位點特異的檢測抗體。這些闡發凡是設想為顯色或熒光檢測。產生的旌旗燈號強度與最初樣品中存在的磷酸化卵白的濃度成反比。與更加傳統的免疫印跡比擬，磷酸化特異的ELISA手藝具備一些長處。起首，操縱顛末校準的規范品，可輕松定量成果。其次，以三明治情勢操縱方針卵白特異的兩個抗體，帶來了高的特同性。第三，ELISA的活絡度更高許可操縱更少量樣品，檢測低品貌的卵白。最初，微孔板情勢的通量比傳統的Western blotting要高很多。ELISA凡是帶來了激酶活性的間接測定。不過，另外一類ELISA手藝操縱牢固化的捕獲抗體、底物和磷酸化底物的檢測方式，帶來激酶活性的更間接測定。

　　基于細胞的ELISA

　　雖然體外生歸天學激酶闡發(如典范的三明治ELISA)常常操縱于假說查驗和藥物遴選，但它們沒法復制細胞內的情況。闡發完全細胞內的卵白磷酸化或許能更精確地代表特定旌旗燈號通路收集的狀況。一些免疫闡發比來被開辟出來，可以或許在完全細胞的背景下測定卵白磷酸化。細胞在同一個孔中被安慰、牢固和阻斷。操縱磷酸化特異抗體，操縱熒光或顯色檢測體系來評價磷酸化狀況。另外，在微孔板的同一個孔中同時檢測磷酸化卵白和總卵白。是以，來自方針卵白的旌旗燈號可經由進程第二種卵白來規范化，校訂各孔之間的差別，實現磷酸化卵白程度的精確評價，并比擬多個樣品，與傳統免疫印跡中操縱磷酸化特異和總卵白抗體類似。這些闡發繞過了制備細胞裂解液的須要，是以更合適高通量闡發。

　　細胞內流式細胞術和ICC/IHC

　　傳統的細胞內流式細胞術和免疫細胞化學/免疫構造化學(ICC/IHC)是檢測磷酸化事務的無力東西。流式細胞儀操縱激光來激起用于抗體檢測的熒光染料。在評價同一個細胞中的多個卵白時，必須經心遴選濾光片組合和熒光染料，其光譜不能堆疊。流式細胞術很有上風，因其實現了疾速、定量的單細胞闡發。經由進程細胞外表標記的分型可檢測異質群體中特定細胞范例的卵白，而無需在物理上分手細胞。經由進程這類方式可闡發罕見的細胞群體，而不必擔憂細胞喪失或細胞分選進程中可以或許產生的卵白抒發變更。

　　ICC凡是指的是操縱顯微鏡對培育細胞中的卵白停止檢測，而IHC指的是對完全構造切片中的卵白停止檢測。與流式細胞術類似，這些手藝實現了細胞或構造內多個卵白的評價，只是要充足正視，防止熒光光譜或色彩的堆疊。熒光和顯色檢測手藝都常常操縱。與監控磷酸化的其余情勢差別，ICC凡是是肯定細胞內定位的首選方式。流式細胞術和ICC/IHC都須要高親和力、高特同性的抗體、阻斷步驟、對比和抗體滴定，以防止因非特同性連系而帶來的不明白成果。

　　經由進程流式細胞術和ICC來檢測磷酸化卵白請求卵白是不變的，且抗體可以或許靠近。細胞凡是顛末安慰，并由甲醛或多聚甲醛牢固，以交聯磷酸化卵白，使其不變，便于闡發。牢固后的細胞必須顛末透化處置，讓磷酸化特異抗體可進入細胞。對差別的亞細胞定位，凡是操縱差別的透化手藝。暖和的去垢劑可實現細胞質卵白的檢測，而抗體要想靠近核卵白，可以或許須要操縱酒精。酒精透化也可加強磷酸化特異抗體的磷酸化卵白檢測，因酒精具備變性的特色。

　　質譜

　　龐雜的生物樣品(如細胞裂解液)中卵白質磷酸化的周全評價(磷酸化卵白質組學)對領會基于磷酸化的旌旗燈號收集很主要。龐雜的卵白夾雜物中大范圍的磷酸化卵白闡發包羅磷酸化卵白和磷酸化肽段的判定，和磷酸化殘基的測序。質譜(MS)手藝是實現這些使命的有效東西。雖然質譜在判定單個卵白上具備超卓的活絡度和分辯率，但對磷酸化卵白的闡發，另有一些固有的堅苦。起首，磷酸化肽段的旌旗燈號凡是較弱，因為它們帶負電荷，而電噴霧質譜在正電情勢下感化，是以電離結果不好。其次，在大批非磷酸化卵白的高背景之下，很難察看到低品貌方針卵白的旌旗燈號。為了降服這些錯誤謬誤，人們已開辟出一些富集戰略，包羅牢固化金屬親和層析(IMAC)、磷酸化特異抗體富集、化學潤色法(如磷酸化絲氨酸和蘇氨酸的β-消去反映)，和用生物素化的基團代替磷酸基團。

　　多個闡發物圖譜闡發

　　質譜手藝如碰撞引誘解離(CID)和電子轉移解離(ETD)，供給了肽段序列和翻譯后潤色(磷酸化)的周全平行闡發。這些手藝相稱吃力，而當特定通路作為首要研討方針時，可以或許不須要周全的磷酸化闡發戰略。這致使一些同時測定多個闡發物的卵白磷酸化的新方式被開辟出來。總的來講，這些方式觸及到磷酸化特異抗體的操縱，包羅基于微孔板、磁珠和膜，基于磁珠和基于膜的檢測情勢。這些闡發最較著的益處在于通量能力被大大進步，防止了運轉多個Western blot或傳統的ELISA闡發的須要。這些手藝也可以或許供給更多的數據，而所需的樣品量少少。響應地，卵白圖譜闡發凡是被以為活絡度不迭傳統的對應手藝，因潛伏的抗體穿插反映性。

　　論斷

　　評價卵白磷酸化常常是細胞生物學家保留曲目中必不可少的一局部，可領會引發細胞活性的細胞內因子。斟酌到激酶表演的主要腳色，研討職員必須要有優良的東西，能力測定卵白磷酸化和/或激酶活性。每種手藝在差別的背景下發揮上風，是以必須經心遴選最合適嘗試設想的方式(表1)。這篇綜述扼要先容了一些評價卵白磷酸化的最常常操縱方式。因為需要在不時增添，方式也在不時改良，讓研討職員可以或許更深上天領會這些龐雜而主要的進程，終究節制細胞功效。