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熒鮮明微鏡手藝道理和方式

[2015/12/31]

  1)練習目標:學習熒形象微鏡的利用率;了解熒形象微鏡活兒理的成語和方試。

  2)嘗試資料 リンク: //web.sgihara.com 生物素標記的dUTP(Biotin-dUTP)或地高辛標記的duUTP(Digoxingening-11-dullP)1 nmol/μL,TdT(25U/μL),反映緩沖液,洗濯緩沖液,異硫氰酸熒光素(FITC)標記的親合素或鏈霉親合素(2.5μg/mL)或抗地高辛抗體(130)PI染液(PI 5μg/mL)PBS緩沖液,蓋玻片,培育的貼壁細胞,懸浮細胞的甩片或涂片,冰凍切片,慣例白臘切片。

  3)操縱步驟
  ①牢固:培育細胞的制片或冰凍切片用4%多聚甲醛牢固30min(4℃冰箱)后,用80%酒精再牢固2h(20℃冰箱);慣例4%中性福爾馬林牢固、白臘切片停止脫蠟、水合。
  ②洗濯:將玻片浸入PBS緩沖液,搖床上洗濯5min,洗3次。
  ③反映:洗濯后的玻片用吸水紙吸干細胞或構造周圍水份,按50μLcm2滴加反映液(50μL反映液含TdT0.5μL,標記的dUTP 1μL),使反映液平均地籠蓋于一切細胞或構造切片上,蓋上塑料蓋玻片,置濕盒中,37℃孵育1h
  ④停止反映:去掉塑料蓋玻片,將玻片置于盛有洗濯緩沖液的染色缸內,洗濯2次,每次5min
  FITC標記:洗濯后的玻片用吸水紙吸去細胞或構造周圍水份,按50μLcm2滴加FITC反映液(FlTC 2.5μg/mL),室溫下避光孵育10min
  ⑥洗濯:將玻片置于洗濯緩沖液內,洗2次,每次5min
  PI復染:將玻片置于盛有Pl染液的染色缸內,室溫下避光染色30min
  ⑧封片:用蓋玻片間接蓋在含PJ染液的玻片上,也可用無色指甲油涂于蓋玻片周圍邊緣,置暗盒中,鏡檢察看。

  4)成果判定用熒鮮明微鏡察看,選用藍色激起光(波長488nm),一切的細胞核均被PI著色,顯現出白色熒光,而凋亡細胞被特異地標記上FITC,顯現出黃綠色熒光。