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基因轉染嘗試(脂質體介導DNA轉染法)

[2015/12/17]

  脂質體(lipofectin regeantLR)試劑是陽離子脂質體N-[1-23-DioleyoxyPropyl]-nnn-Trimethylammonium ChlorideDOTMA)和Dioleoyl photidye-thanolamineDOPE)的夾雜物[11w/w]。它合用于把DNA轉染入懸浮或貼壁培育細胞中,是今朝前提下最便利 的轉染方式之一。轉染率高,優于磷酸鈣法,比它高5~100倍,能把DNARNA轉染到各類細胞。

  LR停止轉染時,起首需優化轉染前提,應找出該批LR對轉染某一特定細胞合適的用量、感化時候等,對每批LR都要做:第一,先要牢固一個DNA的量和DNA/LR夾雜物與細胞彼此感化的時候,DNA可從1~5μg和孵育時候6小時起頭,按這兩個參數繪出響應LR需用量的曲線,再選用LRDNA二者最好的劑量,肯定出轉染時候(2~24小時)。因LR對細胞有必然的毒性,轉染時候以不跨越24小時為好。

  細胞品種:COS-7BHKNIH3T3HelaJurkat等任何一種細胞都可作為受體細胞。

  1、操縱步驟[方式一]
  1)細胞培育:取6孔培育板(或用35mm培育皿),向每孔中插手2mL1~2×105個細胞培育液,37℃CO2培育至40%~60%會合時(會合過度,轉染后倒霉挑選細胞)。
  2)轉染液制備:在聚苯乙稀管中制備以下兩液(為轉染每個孔細胞所用的量)A液:用不含血清培育基濃縮1-10μg DNA,終量100μLB液:用不含血清培育基濃縮2-50μgLR,終量100μL,悄悄夾雜AB液,室溫中置10-15分鐘,稍后會呈現微濁景象,但并不故障轉染(如呈現積淀能夠因LRDNA濃度太高而至,應酌情減量)。
  3)轉染籌辦:用2mL不含血清培育液漂洗兩次,再插手1mL不含血清培育液。
  4)轉染:把A/B復合物徐徐插手培育液中,搖勻,37℃溫箱置6~24小時,吸除無血清轉染液,換入一般培育液持續培育。
  5)其余處置如察看、挑選、檢測等與別的轉染法不異。
  關注著:轉染時時請加血清,血清對轉染權利有非常大的關系。

  2、疾速脂質體轉染法操縱步驟以下[方式二]
  1)以5×105細胞/孔接種6孔板(或35mm培育皿)培育24小時,使其到達50~60%板底面積。
  2)在試管中配制DNA/脂質體復合物方式以下:
  1mL無血清DMEM中濃縮PSV2-neo質粒DNA或供體DNA
  扭轉1秒鐘,再插手脂質體懸液,扭轉。
  室溫下放置5~10分鐘,使DNA連系在脂質體上。
  3)棄去細胞中的舊液,用1mL無血清DMEM洗細胞一次后棄去,向每孔中間接插手1mL DNA/脂質體復合物,37℃培育3~5小時。
  4)再于每孔中插手20%FCSDMEM,持續培育14~24小時,
  5)吸出DMEM/DNA/脂質體夾雜物插手新穎10%FCSDMEM2mL/孔,再培育24~48小時。
  6)用細胞刮或消化法搜集細胞,以備闡發判定。

  3、不變的脂質體轉染方式以下:
  1)接種細胞同前,細胞長至50%板底面積可用于轉染。
  2DNA/脂質體復合物制備轉染細胞同前(2)、(3)步驟。
  3)在每孔中插手1mL20%FCSDMEM37℃培育48小時。
  4)吸出DMEM,用G418挑選培育液濃縮細胞,使細胞發展必然時候,挑選轉染克隆方式參照細胞克隆挑選法停止。