啟示：
　　操縱熒光染劑（bisbenzimide， Hoechst 33258）偵測支原體凈化。此染劑會連系到DNA之Adenosine-Thymidine （A-T） rich地區，由于支原體之DNA中A-T含量占大都（55～80%），以是可將其染色而偵測。被支原體凈化之細胞經染色后，在細胞核外與細胞四周可看到很多巨細均一之熒光小點，即為支原體之DNA，證實有支原體之凈化。 
　　測試步驟用間接步驟，將待測細胞懸浮液或細胞培育液接種于唆使細胞培育液中（indicator cell，比方Vero cell or 3T6 cell），而后培育唆使細胞再作熒光染色。正負反映對比組亦能夠接種于indicator cell內作為對比。 
　　待測上皮生殖內部而能作間接性的測式，但需為降解型上皮生殖內部，繁育后間接性的作熒光染料。有點上皮生殖內部易有熒光的背景，而攪擾成功判讀，則號召根據接種疫苗于唆使上皮生殖內部之步數。 

　　標志性：
　　簡略、經濟與活絡，普遍利用，可作為例行之偵測步驟。能夠偵測不易培育之支原體，比方M. hyorhinis，較間接培育法快，約一禮拜便可曉得成果。 
　　誤區謬誤：巧合仍很有可能熒光圖片背景，決定判讀。 

　　檔案資料：
　　Hanks’ balanced salt solution without NaHCO3 or phenol red（HBSS，GibcoBRL 21250-014﹚、bisbenzimide （Hoechst No.33258，Sigma B-2883）、thimerosol（Sigma T-5125）、0.1M citric acid、02M disodium phosphate、glycerol、glacial acetic acid、methanol、strerile H2O、chamber slide （Nunc 177380）或chamber slide替換物：35 or 60mm sterile plate內安排無菌22x22mm蓋玻片﹙浸于酒精內，利用前偏激滅菌﹚，普通吸附型細胞均能吸附在蓋玻片上。染色后掏出蓋玻片，細胞面朝下放在玻片上察看。 
　　Indicator cells：Vero（African green monkey kidney，ATCC CCL-81 or CCRC 60013）or 3T6（mouse fibroblast，ATCC CCL-96 or CCRC 60070），細胞須先測試無凈化。αMEM with 10%FBS（medium for Vero cell） 

　　專門配制制劑：
　　無菌HBSS：配制Hanks’ balanced salt solution，以0.22mm無菌過濾膜過濾滅菌。勿用高壓蒸汽滅菌。 
　　Hoechst 33258 stock solution（100X）︰稱取5.0 mg bisbenzimide和10.0 mg thimersol溶于100ml無菌HBSS，置于棕色瓶中，室溫下以電磁攪拌器攪拌30分鐘至完整消融后，以1ml分裝至1.5ml小離心管中，儲存于-20℃。 
　　Hoechst 33258 working reagent︰取1ml Hoechst 33258 stock solution，插手sterile 100 ml HBSS中，室溫下攪拌45分鐘，置于棕色瓶中并以鋁箔紙包覆，防止光照，儲存于4℃。 
　　mounting solution：22.2 ml 0.1M citric acid和27.8ml 0.2 M Na2HPO4插手于50ml glycerol中夾雜，以1N NaOH調劑pH至5.5（pH很重要），儲存于4℃。 
　　牢固溶液（fixative）：冰醋酸與甲醇以1︰3之體積比例夾雜，利用前才配制。 

　　步驟： 
　　培育Vero細胞：Vero細胞可作持久培育或建造多個冷凍保管管，測試前凍結培育。測試前一周培育Vero細胞。 
　　在接種測試樣品前一日，以trypsin-EDTA溶液處置Vero細胞，制成細胞懸浮液，以1~2x10^4 cells／ml培育于chamber slide中，每一個well插手1ml細胞懸浮液，于37℃，5％CO2培育。隔日肯定發展杰出后，便可接種測試樣品。 
　　接種測試樣品：樣品品種：1ml待測之培育基，1ml待測細胞培育液（可將細胞略微刮下﹚，0.05~0.1ml冷凍管之細胞懸浮液。 
　　將測試樣品插手chamber slide內，培育5天后，停止Hoechst 33258的熒光染色察看。 
　　以Acholeplasma laidlawii ATCC 23206傳染Vero細胞作為正反映對比組﹙或是已傳染支原體之細胞培育液或冷凍細胞液﹚，負反映對比組為Vero cell之新穎培育基（αMEM +10%FBS）。 

　　DNA熒光染色檢測：
　　掏出培育5日之Vero細胞，吸除培育液。于每一個well中插手2ml 1：3夾雜的冰醋酸/甲醇牢固液，靜置10 min后，吸除牢固液。反復上述之步驟，風干10分鐘。于每一個well中，插手1ml Hoechst 33258 working solution，室溫下靜置30min。 
　　吸掉Hoechst 33258染液后，以無菌水洗濯3次，風干后插手1滴的mounting solution，并以蓋玻片籠蓋之。 
　　以100x-400x熒鮮明微鏡察看。翻開水銀光源10 min后，以UV激起光束（330～380 nm）之濾光鏡，檢查細胞系核外都是不有淡藍色熒光小白點和絲狀點之熒光物的發生。 

　　優秀成果判讀：
　　如有支原體凈化，在Vero細胞核外與細胞外表會呈現藍色熒光小點或是絲狀點。其外形分歧，與細胞殘片染成之不法則點狀物差別。其熒光可保持數禮拜。
　　熒鮮明微鏡下，只察看到Vero細胞的細胞核，測試樣品不支原體的凈化。（為positive result：在Vero細胞核外與細胞外表會呈現藍色熒光小點和絲狀點，表現測試樣品有支原體的凈化。