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Southern轉印闡發方式步驟
[2015/9/11]在膠體中的DNA可操縱毛細景象的感化將DNA牽引轉印至籠蓋在膠片上的濾膜,經烘烤或UV照耀后,可以使DNA牢固在膜上,以停止探針的雜合(hybridization)反映。
儀器器具:
玻璃缸;玻璃板或吸水海綿;Crosslinker
藥品試劑:
10×SSC(1.5MNaCl;0.15Msodium citrate)或20×SSC
變性溶液(1.5M NaCl;0.5 NNaOH)
中和溶液(1MTris-Cl;1.5 M NaCl,pH7.5)
Nylon membrane尼龍膜
40 Methods in Biotechnology Vol 1
Whatman 3MM濾紙
儲水紙
方式步驟:
1)電泳的洋菜膠片,浸于0.25NHCl中15min(當DNA份子量不大時,可省去此步驟);以無菌水潤洗膠片后,將膠片置于變性溶液中,于室溫遲緩震動15min,改換新的變性溶液后再處置15min.
2)以無菌水潤洗膠片,再以中和溶液浸泡30min,其間改換一次。
3)戴手套將尼龍膜剪裁成膠體巨細,在角落剪一缺口作暗號。另裁剪數張較膠片稍小的3MM 濾紙。
4)取一玻璃缸,插手10×SSC。將一塊長形玻璃板架在缸上,裁剪一張長形3MM濾紙,寬度須略大于膠片,將濾紙置于玻璃板上,使濾紙兩頭順著玻璃板垂入缸內溶液中。加一些10×SSC于濾紙上使其濕透,并趕掉濾紙與玻璃板間的氣泡。
如有3~5cm厚的清潔海綿,則可取代玻璃板。可將海綿置于缸中,插手10×SSC,但不可淹過海綿。海綿濕透后,其上放一張比膠片大的3MM濾紙,要趕掉濾紙與海綿間的氣泡。
5)將處置過的膠片置于濾紙上,趕掉氣泡,謹慎將尼龍膜蓋在膠片上,不要有氣泡發生。 再依序蓋上兩張以10×SSC浸潤的濾紙及兩張干的濾紙,并以保鮮膜將膠片周圍封住。最初籠蓋一迭吸水紙,下面放一塊玻璃板或塑料板,以重物壓住便可。在室溫下靜置過個夜。
6)轉印后,謹慎移去重物、吸水紙、3MM 濾紙等,在尼龍膜絕對樣品槽的地位作暗號。將尼龍膜翻開,與膠片打仗面朝上,置于10×SSC中遲緩震動5min,以洗去附著在膜上的洋菜膠。轉印后的膠片可再以EtBr染色,視是不是轉印完整。
7)將尼龍膜置于清潔的濾紙上(與膠片打仗面朝上),移至UVcrosslinker中,停止crosslinking 以將DNA牢固在膜上。
8)枯燥后的尼龍膜便可停止雜合。若不當即停止雜合,可將尼龍膜夾于兩張濾紙間,置于枯燥箱中寄存。
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