聚合酶鏈式反映（Polymerase Chain Reaction，PCR）手藝是基因擴增手藝的一次嚴重改革，是份子生物學成長史中的一個主要里程碑。利用PCR擴增手藝，能夠將極微量的靶DNA片斷特異地擴增上百萬倍，大大進步了對DNA份子的闡發和檢測才能。PCR手藝具備敏感度高、特同性強、疾速簡潔等長處，在醫學、遺傳學、法醫學、微生物學、食物查驗、衛生查驗等浩繁范疇中具備龐大的利用代價和廣漠的成長遠景。

耐熱DNA聚合酶的利用是PCR手藝的焦點。按照是不是具備3’→5’端外切酶活性，耐熱DNA聚合酶凡是分為無校讀活性和有校讀活性兩類。無校讀活性的DNA聚合酶（以Taq 酶為代表）具備較高的擴增效力，但因為缺少校讀活性，輕易產生堿基錯配，故產品中點漸變較多。Taq DNA聚合酶還具備結尾轉移酶活性，可在PCR產品的3’結尾非特異地增添堿基，因單個A凸起堿基的比例最高，故PCR產品可間接與含有3’結尾凸起T堿基的載體毗連（即TA克隆），便利PCR產品的克隆、擴增和測序。但是，TaqDNA聚合酶在PCR反映第一步升溫進程中便可催化錯配引物耽誤或引物二聚體構成，因此致使非特同性擴增，影響目標片斷的分解量。針對這一景象設想的熱啟動Taq DNA聚合酶，在低溫時其聚合酶活性被按捺，經由過程低溫變性，聚合酶的活性規復，催化特同性連系的引物擴增，因此進步了目標片斷的特同性和產量。另外一類有校讀活性的DNA聚合酶（以Pfu為代表）可挑選性地去除毛病摻入的dNTP，保持DNA鏈的準確耽誤；但是其擴增效力凡是低于Taq DNA聚合酶，出格是對長片斷DNA鏈的耽誤才能較差。基于上述兩類酶的特色，可將恰當的Taq DNA聚合酶與肆意一種有校讀活性的DNA聚合酶夾雜，在恰當的反映緩沖液系統中，可取得保真性與擴增機能介于上述兩類酶之間的夾雜酶，用于長片斷和龐雜模板的高保真擴增。

PCR嘗試受諸多身分的影響。優良的貿易化耐熱DNA聚合酶及其配套緩沖液凡是能夠知足絕大大都DNA片斷擴增的須要。起首應按照模板的性子（基因組、cDNA、質粒等）和目標片斷的巨細、GC含量、有沒有二級布局等，挑選適合的DNA聚合酶。對難于擴增的片斷，應針對差別的模板、引物，優化反映前提，以取得最好的擴增效力。

A. 模板用量：以50 μl反映系統為例
? 人基因組DNA：0.1~1.0 μg
? 大腸桿菌基因組DNA：10~100 ng
? λ DNA：0.5~5 ng
? 質粒DNA：0.1~10 ng

B. 引物設想準繩：
? 引物長度要知足特同性須要，普通可在18~25個堿基之間；擴增長片斷時最好在24~30個堿基之間；
? （G+C）%含量應盡可能節制在40~60%，兩條引物的（G+C）%含量應盡可能靠近；
? 盡可能防止不異堿基持續呈現三次以上，3’端應防止利用A或T；
? 防止引物外部本身配對構成二級布局；
? 正反向引物之間應防止配對堿基，特別是3’真個三個堿基，不然易天生引物二聚體（Primer dimer）；
? 兩條引物的Tm值應盡可能靠近，最好相差不跨越5oC；
? 引物Tm值的計較方式：
20 nt以下：Tm = 2x（A + T）+ 4x（G+C）
20 nt以上：Tm = 81.5+0.41x（G+C%）-600/nt（nt：引物的堿基數）

C. 引物用量：
? 0.1~1.0 μM，凡是能夠0.2 μM肇端，按照系統差別調劑用量；
? 利用簡并引物、隨機引物時，需增添引物總量以填補產量喪失；但跟著引物量加大，特同性將下降；
? 模板較大較多，或布局較龐雜（如人基因組DNA）時，需削減引物用量以進步特同性；
? 模板較小較少（如質粒模板）時，增添引物用量可進步產量。