保持ES細胞處于未分解狀況：

　　ES細胞培育用含有 ESGRO(白血病按捺因子)的高糖培育基來禁止細胞的分解。為細胞供給包被有0.1%明膠的平板作為粘附細胞的基質。倡議每2-3天從到達 80%-90%融會的平板按1：8的比率傳代細胞一次，細胞傳代今后，在將細胞接種在0.1%明膠包被的培育皿之前，經由過程事后將細胞接種在不顛末包被的構造培育板2個小時，使分解細胞粘附，從而將分解和未分解細胞分隔。將細胞全程置于37℃，5%CO2，100%濕度前提下培育。

　　培育基：ES：配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液(該溶液也能用于EB培育基--見下文)。分裝在50ml FALCON管中，(濃縮為2×，每管42ml)，儲存在-20℃。經由過程將21ml該溶液，HS和ESGRO插手450mlDMEM中制備培育基，0.2μm濾膜過濾。儲存于4℃。

　　注：一瓶DMEM是500ml。

　　儲存液：DMEM(高糖)、馬血清(HS)、L-谷氨酰胺(200mM)、MEM NEAA(10mM)、HEPES(1M)、β-巰基乙醇(55Mm)、PEST、ESGRO。

　　蘇醒細胞：細胞被凍存在10%二甲基亞砜(DMSO)中避免結晶的構成，結晶的構成會侵害細胞。但是，二甲基亞砜對細胞有毒性，疾速的停止細胞蘇醒是很主要的。

　　操縱步驟：

　　1.從液氮中掏出一管細胞;

　　2.將凍存管置于37℃水浴中2分鐘(或放到管內溶液剛好完整消融);

　　3.將細胞轉移到一15ml Falcon管中;

　　4.插手5ml ES培育基(用培育基沖刷凍存管);

　　5.離心3分鐘;

　　6.棄上清，用2ml ES培育基重懸細胞，最少奏樂10次;

　　7.接種在明膠包被(見下文)的6孔或6cm構造培育皿;

　　8.孵育。

　　凍存細胞

　　凍存液：90%HS和10%二甲基亞砜

　　步驟：

　　1.1×PBS洗細胞并留少量PBS在培育皿內;

　　2.用細胞刮刀搜集細胞;

　　3.將細胞轉入15ml Falcon管內并離心3分鐘;

　　4.棄去上清并將細胞重懸于冷的凍存液中(10cm的培育皿用2ml，15cm的培育皿用6-7ml。)

　　5.分裝于凍存管內，每管1ml;

　　6.置-80℃留宿，第二天移入液氮。

　　明膠包被：籌辦500ml 0.1%明膠溶液

　　1.將0.5g明膠消融在500ml無鈣鎂的PBS中(50-65℃水浴15～30分鐘)。

　　2.最好在溶液不冷卻的環境下經由過程0.2μm濾膜過濾，儲存在4℃。

　　包被培育板或培育皿

　　1.插手充足的明膠溶液籠蓋培育立體(15cm培育皿加2ml，10cm培育皿加0.5～1ml，溶液的量并不主要，只需能完整籠蓋培育外表就好了。);

　　2.置室溫30分鐘;

　　3.去除明膠溶液，將培育板儲存在包裝袋中室溫安排，最好將板子平方，以避免明膠凈化蓋子和流出培育板。