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微生物菌種收藏方式
[2013/10/31]
1、傳代保管法:有些微生物當碰到冷凍或枯燥等處置時,會很快滅亡,是以在這類環境下,只能乞助于傳代培育保管法。傳代培育便是要按期地遏制菌種轉接、培育后再保管,它是最根基的微生物保管法,比方酸奶等常常操縱出產菌種的保管。傳代保管時,培育基的濃度不宜太高,養分成份不宜過于豐碩,出格是碳水化合物的濃度應在能夠的規模內盡可能降落。培育溫度凡是以稍低于最適發展溫度為好。若為產酸菌種,則應在培育基中增添少許碳酸鈣。
通俗地,大大都菌種的收藏溫度以5℃為好,像厭氧菌、霍亂弧菌及局部病原真菌等微生物菌種則能夠操縱37℃遏制保管,而蕈類等大型食用菌的菌種則能夠室溫間接保管。傳代培育保管法固然簡潔,但其錯誤謬誤也很較著,如:①菌種管棉塞常常輕易發霉;②菌株的遺傳性狀輕易產生變異;③頻頻傳代時,菌株的病原性、構成心理活性物資的才能和構成孢子的才能等均有降落;④須要按期轉種,任務量大;⑤雜菌的凈化機遇較多。
2、液體白臘籠蓋保管法:該法較前一種方式保管菌種的時候更長,合用于霉菌、酵母菌、放線菌及需氧細菌等的保管。此法可防止枯燥,并經由進程限定氧的供應而到達減弱微生物代謝感化的目標。其具備方式簡潔的長處,同時也合用于不宜冷凍枯燥的微生物(如產孢才能低的絲狀菌)的保管,而某些細菌如固氮菌、乳酸桿菌、明串珠菌、分枝桿菌、紅螺菌及梵衲氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克銀漢霉、毛霉、根霉等不宜接納此法遏制保管。
3、載體保管法:行將微生物吸附在恰當載體上遏制枯燥保管的方式。常常操縱的無方式包含以下幾種,如
①泥土保管法:首要用于能構成孢子或孢囊的微生物菌種的收藏。方式是在滅菌的泥土中插手菌液,當即在室溫下遏制枯燥或使菌體滋生后再枯燥,而后冷藏或在室溫下密封保管。保管用的泥土準繩上以肥饒的耕土為好,泥土需風干、破壞、過篩和滅菌。使微生物在泥土中滋生后遏制枯燥保管的方式是:取恰當泥土(5克)置于塞有棉塞的試管中,加水或插手充實濃縮的液體培育基(以含水量為泥土最大持水量的60%為好),而后高壓滅菌。再將需保管的微生物遏制大批接種,培育至菌絲能用肉眼確認的水平為止,移入枯燥器中經短時候枯燥或風干后密封,冷藏或室溫保管。
②砂土保管法:取干凈的砂,篩去掉大砂粒,并用磁鐵吸去砂中鐵屑,再用NaOH溶液、10%HCl溶液和水瓜代洗濯數次,枯燥后,置于試管或安瓶管中堅持2~3cm深,再經干熱滅菌后,插手1ml菌種培育液,經充實混勻后,放入真空枯燥器中,完整枯燥后熔封保管。也可用二份洗凈的砂(經HCl預處置)和一份瘠薄、過篩的黃土攙雜后滅菌,再遏制菌種收藏。
③硅膠保管法:以6~16目標無色硅膠取代砂子,干熱滅菌后,插手菌液。加菌液時,由于硅膠的吸附熱常使溫度降低,是以需想法加以冷卻。
④磁珠保管法:將菌液浸入素燒磁珠(或多孔玻璃珠)后再遏制枯燥保管的一種方式。在螺旋面試管中裝入1/2管高的硅膠(或無水CaSO4),上鋪玻璃棉,再放上10~20粒磁珠,經干熱滅菌后,接入菌懸液,最初冷藏、室溫收藏或減壓枯燥后密封收藏。本法對酵母菌很有用,出格合用于根瘤菌,可保管長達兩年半時候。
⑤麩皮保管法:在麩皮內插手60%的水,經滅菌后接種培育,最初枯燥收藏。
⑥紙片(濾紙)保管法:將滅菌紙片浸入培育液或菌懸液中,常壓或減壓枯燥后,置于裝有枯燥劑的容器內遏制保管。
4、懸液保管法:即便微生物混懸于恰當溶液中遏制保管的方式。常常操縱的有,
①蒸餾水保管法:合用于霉菌、酵母菌及絕大局部放線菌,將其菌體懸浮于蒸餾水中便可在室溫下保管數年。本法應注重防止水份的蒸發。
②糖液保管法:合用于酵母菌,如將其菌體懸浮于10%的蔗糖溶液中,而后于冷暗處保管,可長達10年。除此以外,也可操縱緩沖液或食鹽水等遏制保管。
5、寄主保管法:即令微生物侵入其寄主后加以保管的方式。
6、冷凍保管法:合用于抗凍力強的微生物。這些微生物可在其菌體細胞外蒙受解凍的環境下而不受毀傷,而對別的大大都微生物而言,不管在細胞外解凍仍是在細胞內解凍,城市對菌體構成毀傷,是以當接納這類收藏方式時,應注重以下幾點,
①要挑選適于冷凍枯燥的菌齡細胞;
②要挑選適合的培育基,由于某些微生物對冷凍的抵當力,常隨培育基成份的變更而顯現出龐大差別;
③要挑選適合的菌液濃度,凡是菌液濃度越高,保管率越高,保管期也越長;
④最好在菌液內不增添電解質(如食鹽等);
⑤可在菌液內增添甘油等掩護劑,以防止在冷凍進程中呈現菌體大批滅亡的景象。一樣,也可增添各類糖類、去纖維血液和脫脂牛乳等具備杰出掩護結果的溶劑,但對有些微生物而言,不加掩護劑時更有用。
⑥準繩上應盡快遏制冷凍處置,但當插手掩護劑時,可靜置一段時候后再遏制處置。
⑦就植物細胞而言,應在-20℃規模內以1℃/min擺布的速率遲緩降溫,爾后必須盡快降到儲藏溫度;而對絕大大都微生物而言,則不必如斯,如布局較為龐雜的原蟲則可在-35℃規模內遏制遲緩降溫,而噬菌體則必需接納上述的二階段法遏制冷凍;
⑧若遏制持久保管,則儲藏溫度越低越好;
⑨取用冷凍保管的菌種時,應采用速融辦法,即在35~40℃溫水中悄悄振蕩使之敏捷融解。而就厭氧菌來講,則應挑選靜置熔化的辦法。當冷凍菌熔化后,應盡可能防止再次冷凍,不然菌體的存活率將明顯降落。
常常操縱的冷凍保管法包含:
①高溫冰箱保管法(-20℃、-50℃或-85℃):高溫冷凍保管時操縱螺旋面試管較為便利,也可在棉塞試管外包裹塑料薄膜。保管時菌液加量不宜過量,有些可增添掩護劑。另外,也可用φ5mm的玻璃珠來吸附菌液,而后把玻璃珠置于塑料容器內,再放入高溫冰箱內遏制保管的。
②干冰保管法(-70℃擺布):行將菌種管拔出干冰內,再置于冰箱內遏制冷凍保管。
③液氮保管法(-196℃):是合用規模最廣的微生物保管法。其操縱步驟以下,
a、裝安瓶管:操縱盡可能稠密的菌體懸浮于含有恰當防凍劑(保管霉菌不必防凍劑)的滅菌溶液中,將0.2~1ml的這類溶液分裝于安瓶中,或在裝有分離劑的安瓶中間接接種,或將菌絲體瓊脂塊間接懸浮于分離劑中。
b、熔封安瓶管:若間接儲存于氣相液氮中(-150℃~-170℃)時,則不需熔封。
c、查抄安瓶管是不是熔封杰出:即在4℃下,將熔封安瓶管在恰當的色素溶液中浸泡2~30分鐘后,察看有沒有色素進入安瓶。
d、遲緩冷卻:將熔封安瓶管置于小罐中,而后用液氮氣以約1℃/min的速率冷卻至-25℃擺布,也可在-20℃~-25℃的冰箱內遲緩冷卻30~60min。
e、速冷:最初浸入液氮中疾速冷卻至-196℃。
7、冷凍枯燥保管法:其道理是起首將微生物冷凍,而后在減壓下操縱升華景象撤除水份。現實上,從菌體中撤除大局部水份后,細胞的心理勾當就會遏制,是以能夠到達持久保持性命狀況的目標。該方式合用于絕大大都微生物菌種(包含噬菌體和立克次氏體等)的保管。在遏制冷凍枯燥時,需注重以下幾個題目:
a、冷凍枯燥前的培育前提:起首查驗菌種純度。通俗地說,將待保管的微生物在養分豐碩且輕易增菌的培育基上遏制培育為好;菌齡以到達對數發展期為好;若為有芽孢或孢子的微生物,則以芽孢和孢子構成今后遏制保管為好;菌液濃度以高為好,如細菌應到達109~1010/ml。
b、菌株號碼等的標記:可在安瓶外側標記或在安瓶內封入標簽。
c、安瓶的籌辦:將安瓶在2%HCl中浸泡留宿,自來水沖刷3次后,蒸餾水刷凈,枯燥,塞棉塞,貼標簽,干熱滅菌或溫熱滅菌后,60℃恒溫枯燥。
d、增添掩護劑:常常操縱的掩護劑有脫脂乳、12%蔗糖、加7.5%葡萄糖的通俗肉湯和加7.5%葡萄糖的血清等等。
8、甘油管收藏法:在5ml菌種收藏管中,將等體積的菌懸液和40%的甘油充實混勻后,于-20℃冰箱中保管。
通俗地,大大都菌種的收藏溫度以5℃為好,像厭氧菌、霍亂弧菌及局部病原真菌等微生物菌種則能夠操縱37℃遏制保管,而蕈類等大型食用菌的菌種則能夠室溫間接保管。傳代培育保管法固然簡潔,但其錯誤謬誤也很較著,如:①菌種管棉塞常常輕易發霉;②菌株的遺傳性狀輕易產生變異;③頻頻傳代時,菌株的病原性、構成心理活性物資的才能和構成孢子的才能等均有降落;④須要按期轉種,任務量大;⑤雜菌的凈化機遇較多。
2、液體白臘籠蓋保管法:該法較前一種方式保管菌種的時候更長,合用于霉菌、酵母菌、放線菌及需氧細菌等的保管。此法可防止枯燥,并經由進程限定氧的供應而到達減弱微生物代謝感化的目標。其具備方式簡潔的長處,同時也合用于不宜冷凍枯燥的微生物(如產孢才能低的絲狀菌)的保管,而某些細菌如固氮菌、乳酸桿菌、明串珠菌、分枝桿菌、紅螺菌及梵衲氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克銀漢霉、毛霉、根霉等不宜接納此法遏制保管。
3、載體保管法:行將微生物吸附在恰當載體上遏制枯燥保管的方式。常常操縱的無方式包含以下幾種,如
①泥土保管法:首要用于能構成孢子或孢囊的微生物菌種的收藏。方式是在滅菌的泥土中插手菌液,當即在室溫下遏制枯燥或使菌體滋生后再枯燥,而后冷藏或在室溫下密封保管。保管用的泥土準繩上以肥饒的耕土為好,泥土需風干、破壞、過篩和滅菌。使微生物在泥土中滋生后遏制枯燥保管的方式是:取恰當泥土(5克)置于塞有棉塞的試管中,加水或插手充實濃縮的液體培育基(以含水量為泥土最大持水量的60%為好),而后高壓滅菌。再將需保管的微生物遏制大批接種,培育至菌絲能用肉眼確認的水平為止,移入枯燥器中經短時候枯燥或風干后密封,冷藏或室溫保管。
②砂土保管法:取干凈的砂,篩去掉大砂粒,并用磁鐵吸去砂中鐵屑,再用NaOH溶液、10%HCl溶液和水瓜代洗濯數次,枯燥后,置于試管或安瓶管中堅持2~3cm深,再經干熱滅菌后,插手1ml菌種培育液,經充實混勻后,放入真空枯燥器中,完整枯燥后熔封保管。也可用二份洗凈的砂(經HCl預處置)和一份瘠薄、過篩的黃土攙雜后滅菌,再遏制菌種收藏。
③硅膠保管法:以6~16目標無色硅膠取代砂子,干熱滅菌后,插手菌液。加菌液時,由于硅膠的吸附熱常使溫度降低,是以需想法加以冷卻。
④磁珠保管法:將菌液浸入素燒磁珠(或多孔玻璃珠)后再遏制枯燥保管的一種方式。在螺旋面試管中裝入1/2管高的硅膠(或無水CaSO4),上鋪玻璃棉,再放上10~20粒磁珠,經干熱滅菌后,接入菌懸液,最初冷藏、室溫收藏或減壓枯燥后密封收藏。本法對酵母菌很有用,出格合用于根瘤菌,可保管長達兩年半時候。
⑤麩皮保管法:在麩皮內插手60%的水,經滅菌后接種培育,最初枯燥收藏。
⑥紙片(濾紙)保管法:將滅菌紙片浸入培育液或菌懸液中,常壓或減壓枯燥后,置于裝有枯燥劑的容器內遏制保管。
4、懸液保管法:即便微生物混懸于恰當溶液中遏制保管的方式。常常操縱的有,
①蒸餾水保管法:合用于霉菌、酵母菌及絕大局部放線菌,將其菌體懸浮于蒸餾水中便可在室溫下保管數年。本法應注重防止水份的蒸發。
②糖液保管法:合用于酵母菌,如將其菌體懸浮于10%的蔗糖溶液中,而后于冷暗處保管,可長達10年。除此以外,也可操縱緩沖液或食鹽水等遏制保管。
5、寄主保管法:即令微生物侵入其寄主后加以保管的方式。
6、冷凍保管法:合用于抗凍力強的微生物。這些微生物可在其菌體細胞外蒙受解凍的環境下而不受毀傷,而對別的大大都微生物而言,不管在細胞外解凍仍是在細胞內解凍,城市對菌體構成毀傷,是以當接納這類收藏方式時,應注重以下幾點,
①要挑選適于冷凍枯燥的菌齡細胞;
②要挑選適合的培育基,由于某些微生物對冷凍的抵當力,常隨培育基成份的變更而顯現出龐大差別;
③要挑選適合的菌液濃度,凡是菌液濃度越高,保管率越高,保管期也越長;
④最好在菌液內不增添電解質(如食鹽等);
⑤可在菌液內增添甘油等掩護劑,以防止在冷凍進程中呈現菌體大批滅亡的景象。一樣,也可增添各類糖類、去纖維血液和脫脂牛乳等具備杰出掩護結果的溶劑,但對有些微生物而言,不加掩護劑時更有用。
⑥準繩上應盡快遏制冷凍處置,但當插手掩護劑時,可靜置一段時候后再遏制處置。
⑦就植物細胞而言,應在-20℃規模內以1℃/min擺布的速率遲緩降溫,爾后必須盡快降到儲藏溫度;而對絕大大都微生物而言,則不必如斯,如布局較為龐雜的原蟲則可在-35℃規模內遏制遲緩降溫,而噬菌體則必需接納上述的二階段法遏制冷凍;
⑧若遏制持久保管,則儲藏溫度越低越好;
⑨取用冷凍保管的菌種時,應采用速融辦法,即在35~40℃溫水中悄悄振蕩使之敏捷融解。而就厭氧菌來講,則應挑選靜置熔化的辦法。當冷凍菌熔化后,應盡可能防止再次冷凍,不然菌體的存活率將明顯降落。
常常操縱的冷凍保管法包含:
①高溫冰箱保管法(-20℃、-50℃或-85℃):高溫冷凍保管時操縱螺旋面試管較為便利,也可在棉塞試管外包裹塑料薄膜。保管時菌液加量不宜過量,有些可增添掩護劑。另外,也可用φ5mm的玻璃珠來吸附菌液,而后把玻璃珠置于塑料容器內,再放入高溫冰箱內遏制保管的。
②干冰保管法(-70℃擺布):行將菌種管拔出干冰內,再置于冰箱內遏制冷凍保管。
③液氮保管法(-196℃):是合用規模最廣的微生物保管法。其操縱步驟以下,
a、裝安瓶管:操縱盡可能稠密的菌體懸浮于含有恰當防凍劑(保管霉菌不必防凍劑)的滅菌溶液中,將0.2~1ml的這類溶液分裝于安瓶中,或在裝有分離劑的安瓶中間接接種,或將菌絲體瓊脂塊間接懸浮于分離劑中。
b、熔封安瓶管:若間接儲存于氣相液氮中(-150℃~-170℃)時,則不需熔封。
c、查抄安瓶管是不是熔封杰出:即在4℃下,將熔封安瓶管在恰當的色素溶液中浸泡2~30分鐘后,察看有沒有色素進入安瓶。
d、遲緩冷卻:將熔封安瓶管置于小罐中,而后用液氮氣以約1℃/min的速率冷卻至-25℃擺布,也可在-20℃~-25℃的冰箱內遲緩冷卻30~60min。
e、速冷:最初浸入液氮中疾速冷卻至-196℃。
7、冷凍枯燥保管法:其道理是起首將微生物冷凍,而后在減壓下操縱升華景象撤除水份。現實上,從菌體中撤除大局部水份后,細胞的心理勾當就會遏制,是以能夠到達持久保持性命狀況的目標。該方式合用于絕大大都微生物菌種(包含噬菌體和立克次氏體等)的保管。在遏制冷凍枯燥時,需注重以下幾個題目:
a、冷凍枯燥前的培育前提:起首查驗菌種純度。通俗地說,將待保管的微生物在養分豐碩且輕易增菌的培育基上遏制培育為好;菌齡以到達對數發展期為好;若為有芽孢或孢子的微生物,則以芽孢和孢子構成今后遏制保管為好;菌液濃度以高為好,如細菌應到達109~1010/ml。
b、菌株號碼等的標記:可在安瓶外側標記或在安瓶內封入標簽。
c、安瓶的籌辦:將安瓶在2%HCl中浸泡留宿,自來水沖刷3次后,蒸餾水刷凈,枯燥,塞棉塞,貼標簽,干熱滅菌或溫熱滅菌后,60℃恒溫枯燥。
d、增添掩護劑:常常操縱的掩護劑有脫脂乳、12%蔗糖、加7.5%葡萄糖的通俗肉湯和加7.5%葡萄糖的血清等等。
8、甘油管收藏法:在5ml菌種收藏管中,將等體積的菌懸液和40%的甘油充實混勻后,于-20℃冰箱中保管。
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