在設想IHC/ICC嘗試時，一抗的挑選是相稱首要的。IHC/ICC嘗試的一切步驟都必須顛末優化，以便察看到特異染色，并盡可以或許削減非特異的背景染色。這包羅展開預嘗試，以肯定每一個一抗的恰當孵育前提。抗原親和純化的多克隆抗體的濃縮度凡是低于單克隆抗體，但這些值必須按照經歷肯定。為了取得靠得住特異的旌旗燈號，應接納穿插反映性少少的高品德抗體。

　　一抗孵育的肇端前提

　　單克隆抗體多克隆抗體

　　構造5-25 µg/mL，4 °C孵育留宿1.7-15 µg/mL，4 °C孵育留宿

　　細胞5-25 µg/mL，室溫下1小時1.7-15 µg/mL，室溫下1小時

　　上風 單表位特同性所需濃度較低

　　限定 易受表位掩蔽的影響異質群體

　　挑選一抗供給商

　　在搜刮一抗時，產物很可以或許有幾個差別的貿易來歷，而它們的抗體品德可以或許整齊不齊。最后的挑選或許決議了這是個勝利的嘗試，抑或是個錯失的機遇。第一步是尋覓自力考證。這包羅在文獻中查抄抗體曩昔是不是勝利利用。很多供給商(包羅R&D Systems)都可覺得尋覓這一信息的研討職員供給輔佐。另外一個題目是扣問抗體是不是真的由供給商制作，仍是它推銷了以后轉售?間接采辦確保了貿易來歷對制作、品德節制流程、和運輸和貯存前提的完整節制。另外，一旦抗體的利用呈現題目，制作商會處于供給優良手藝辦事的最好位置。

　　挑選單克隆仍是多克隆抗體

　　單克隆和多克隆抗體的內涵特點決議了它們用于IHC/ICC時的上風和限定。單克隆抗體由單個B細胞克隆發生，代表了同質群體，可以或許高親和力高特同性地與單個表位連系。這在檢測卵白家屬的某個成員時出格有效，由于卵白家屬有著高比例的氨基酸同源性。

　　抗體連系常常依靠于方針卵白堅持其自然的構思狀況。與其余卵白的彼此感化、翻譯后潤色、溫度、pH、牢固和鹽濃度城市影響抗體靠近方針表位。多克隆抗體是異質的，可辨認多個表位，是以它們較少遭到卵白構象變更的影響。普通而言，多克隆抗體在必然pH和鹽濃度規模內也比單克隆抗體更加穩定。基于這些緣由，多克隆抗體更經常利用于IHC/ICC嘗試。

　　多克隆抗體的親和純化

　　多克隆抗血清是抗體夾雜物，它們由大批B細胞克隆發生。構成多克隆抗血清的抗體以差別的特同性和親和力與方針表位連系，也與不相干的方針份子穿插反映(非特異彼此感化)。為了富集與方針抗原特同性和親和力最高的抗體，R&D Systems的多克隆抗體顛末抗原親和純化。在此進程中，多克隆抗血清流過包羅牢固化抗原份子的親和柱。特異抗體被牢固化抗原保留，而非特異抗體流過柱子，被拋棄。隨后從柱子上洗脫經抗原親和純化的抗體。抗原親和純化的抗體首要與方針抗原彼此感化，下降了背景染色，與未純化抗體比擬發生了更分歧的成果。

　　一抗孵育的優化

　　一抗濃度、濃縮液、孵育時候和溫度都影響了染色品德。這些變量須要針對每一個抗體和樣品來優化，以便完成特異染色和低背景。優化凡是是堅持孵育時候和溫度穩定，而轉變抗體濃度，以肯定什么時候取得最好旌旗燈號和低背景樂音。比方，若是利用高親和力的抗體，那末絕對較高的濃度可以或許須要較短的孵育時候。相反，較低的抗體濃度可以或許須要較長的孵育時候。人們凡是接納較長的孵育時候，以確保抗體完整滲入到體視學手藝所用的構造切片。為了增進特異染色，較永劫候的孵育凡是在高溫下展開(即4 °C vs 室溫)。

　　R&D Systems構造切片染色計劃的優化凡是是從一抗在4 °C孵育留宿起頭的。對細胞染色，人們凡是挑選在室溫下與一抗配合孵育1小時。抗原親和純化過的多克隆抗體的任務濃度(1.7-15 µg/mL)凡是比單克隆抗體(5-25 µg/mL)要低。在比擬差別濃度的不異抗體染色的樣品時，在孵育步驟時必須利用分歧的時候和濃度。當第一次利用新抗體時，倡議展開預嘗試，查驗各類抗體濃度。