檢測體例

　　操縱酶聯免疫吸附測定法用食物及飼料中三聚氰胺的定量測定。

　　檢測道理

　　酶聯免疫吸附測定法定量測定三聚氰胺殘留。操縱萃取液經由進程均質及振蕩的體例提取樣品中的三聚氰胺遏制免疫測定。先將三聚氰胺酶標記物，樣品萃取物及規范插手到已包被有三聚氰胺抗體的微孔中起頭反映。在30分鐘的孵育進程中，樣品萃取物中的三聚氰胺與三聚氰胺酶標記物合作連系微孔中的三聚氰胺抗體，孵育30分鐘后洗掉小孔中一切不連系的三聚氰胺及三聚氰胺酶標記物。在用去離子水洗濯竣事后，每孔中插手清亮的底物溶液，連系的酶標記物將無色的底物轉化為藍色的物資。孵育30分鐘后遏制此反映，根據各孔色彩深淺遏制數據讀取。根據規范的色彩得出樣品中三聚氰胺的的濃度值。

　　嘗試所需裝備及資料

　　三聚氰胺檢測試劑盒

　　酶標儀一臺(配有450nm濾光片)

　　1-5ml可調移液器

　　100-1000ul可調移液器.

　　20-200ul可調移液器.

　　蒸餾水或去離子水..

　　可接收50ul的移液器及吸頭.

　　可接收50ul和100ul的八道移液器及吸頭.

　　吸水紙或相稱的吸水資料.

　　450nm的酶標儀.

　　計時器.

　　洗瓶

　　混旋器.

　　20mM PBS： 0.62g NaH2PO4-2H2O+5.73gNa2HPO4-12H2O+9gNaCl ,蒸餾水定容至1000ml.

　　注重事變

　　最好配套利用試劑，不要同別的公司的產物混用，不要將差別批次的產物混用。

　　樣品濃縮或含有雜質很能夠對成果的精確性有影響。

　　不要利用過時的產物。

　　利用之前將一切試劑上升至室溫，但不要安排跨越24小時。

　　三聚氰胺屬于有毒性的化學品，請謹慎處置。

　　遏制液是1N鹽酸，防止打仗皮膚。

　　樣品制備 (以美國Beacon試劑為例)

　　濕的寵物食物萃取體例(濃縮倍數：100)

　　均質樣品至布丁狀。

　　稱取2g樣品插手10mL 60%甲醇/水溶液，并猛烈振蕩。

　　超聲萃取1分鐘。

　　旋渦夾雜1分鐘，而后靜置5分鐘，使樣品分層。

　　3000 g 室溫離心5分鐘。

　　用玻璃纖維濾紙過濾上清液，并將萃取液搜集于一清潔試管中。

　　用樣品濃縮液將濾液20倍濃縮(如：0.1mL濾液+1.9mL 10%甲醇/20mMPBS)

　　移取150 ul 遏制闡發。

　　注重：用此體例測定了8個增添有15ppm三聚氰胺的貓糧(非請求召回)，收受接管率規模為75%-117%。

　　本體例只可作為樣品挑選體例，不可作為終究確認體例。

　　小麥面筋卵白萃取體例：(濃縮倍數：500)

　　1.均質或混勻小麥面筋卵白樣品。

　　2.稱取0.2g均質好的樣品插手10mL 酸化的60%甲醇/水溶液(1mL 1N HCl/ 100mL 60%甲醇/水)。

　　3.旋渦夾雜并超聲萃取，使樣品消融(確保樣品中不結塊)。

　　4.用樣品濃縮液濃縮萃取液根據1:10比例。(0.5mL+4.5mL 10%MeOH/20 mM PBS)。

　　5.10000轉/分手心上清液10分鐘。

　　6.用G6玻璃纖維濾紙過濾上清液，并將萃取液搜集于一清潔試管中。

　　7.移取150 ul 遏制闡發。

　　注重：若是樣品中含有大批的增添物，須要插手更大批的萃取溶液，以保障萃取效力。

　　操縱人根據本身的鑒定力，若是測試成果比擬高，須要插手兩倍的萃取溶液(0.2/20mL)，遏制二次測定。

　　干的寵物食物萃取體例(濃縮倍數：200)

　　1.質器均質干的寵物飼料樣品。

　　2.稱取1g樣品插手10mL 60%甲醇/水溶液，并猛烈振蕩。

　　3.超聲萃取1分鐘。旋渦夾雜1分鐘，而后靜置5分鐘，使樣品分層。

　　4.3000 g 室溫離心5分鐘。

　　5.用G6玻璃纖維濾紙過濾上清液，并將萃取液搜集于一清潔試管中。

　　6.用樣品濃縮液將濾液20倍濃縮(如：0.1mL濾液+1.9mL 10%甲醇/20mMPBS)

　　7.移取150 ul 遏制闡發。

　　免疫測定進程 (注重: 規范及樣品最好做平行嘗試以增添精確度)

　　將一切試劑及樣品上升至室溫20-280C，但不要安排跨越24小時。

　　從鋁箔袋中拿出請求數目的微孔條，放入枯燥劑偏重新封好袋子以防止微孔條受潮

　　接收150ul規范、樣品到對應微孔中，必須保障每種溶液利用清潔的吸頭接收，防止穿插凈化。 插手50ul三聚氰胺酶標記溶液到每一個小孔中。

　　夾雜60秒，20-28攝氏度下孵育30分鐘。

　　將微孔中的溶液倒入水槽中，用蒸餾水完整布滿微孔，震動后倒掉，反復三次，統共四次洗板。

　　在吸水紙上拍打，盡能夠將水拍干。

　　每一個微孔中插手100ul底物溶液。

　　20-28攝氏度下，孵育30分鐘。

　　每一個微孔中插手100ul遏制液。

　　450nm下讀板。

　　成果闡發

　　半定量的成果是由樣品的吸光率與規范的吸光率的簡略對照而來鑒定:樣品的色彩比規范的色彩淺則三聚氰胺的濃度比規范樣的濃度高, 樣品的色彩比規范的色彩深則三聚氰胺的濃度比規范樣的濃度低。

　　定量闡發須要繪制以規范樣的吸光率為X軸,以規范樣的濃度的半對數為Y軸的曲線圖.根據規范樣吸光率的點畫成一直線,如斯樣品的光接收率可在線上找到,與此絕對應的Y軸則為樣品的濃度,樣品光接收率規模應比規范樣的最底規模高,比最高規模低, 便可申明此樣品中三聚氰胺的含量大于500ppb或小于20ppb。