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紫外接收法測卵白質含量

[2013/7/8]
  卵白質份子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環含有共軛雙鍵,使卵白質具備接收紫外光的性子。接收岑嶺在280nm處,其吸光度(即光密度值)與卵白質含量成反比。另外,卵白質溶液在238nm的光接收值與肽鍵含量成反比。操縱必然波長下,卵白質溶液的光接收值與卵白質濃度的反比干系,能夠停止卵白質含量的測定。

  紫外接收法簡潔、活絡、疾速,不耗損樣品,測定后仍能收受接管利用。低濃度的鹽,比方生化制備中常用的(NH4)2SO4等和大大都緩沖液不攪擾測定。出格合用于柱層析洗脫液的疾速持續檢測,因為此時只要測定卵白質濃度的變更,而不需曉得其相對值。

  此法的特色是測定卵白質含量的精確度較差,攪擾物資多,在用規范曲線法測定卵白質含量時,對那些與規范卵白質中酪氨酸和色氨酸含量差別大的卵白質,有必然的偏差。故該法適于用測定與規范卵白質氨基酸構成類似的卵白質。若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等接收紫外光的物資,會呈現較大的攪擾。核酸的攪擾能夠經由過程查校訂表,再停止計較的方式,加以恰當的校訂。可是因為差別的卵白質和核酸的紫外接收是不不異的,固然顛末校訂,測定的成果仍是存在必然的偏差。

  另外,停止紫外接收法測定時,因為卵白質接收岑嶺常因pH的轉變而有變更,是以要注重溶液的pH值,測定樣品時的pH要與測定規范曲線的pH相分歧。

  1.280nm的光接收法

  因卵白質份子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm處具備最大接收,且各類卵白質的這三種氨基酸的含量差別不大,是以測定卵白質溶液在280nm處的吸光度值是最常用的紫外接收法。

  測定時,將待測卵白質溶液倒入石英比色皿中,用配制卵白質溶液的溶劑(水或緩沖液)作空缺對比,在紫外分光度計上間接讀取280nm的吸光度值A280。卵白質濃度可節制在0.1~1.0mg/ml擺布。凡是用1cm光徑的規范石英比色皿,盛有濃度為1mg/ml的卵白質溶液時,A280約為1.0擺布。由此可當即計較出卵白質的大抵濃度。

  很多卵白質在必然濃度和必然波長下的光接收值(A1%1cm)有文獻數據可查,按照此光接收值能夠較精確地計較卵白質濃度。下式列出了卵白質濃度與(A1%1cm)值(即卵白質溶液濃度為1%,光徑為1cm時的光接收值)的干系。文獻值A1%1cm,λ稱為百分接收系數或比接收系數。

  卵白質濃度= (A280´10 )/ A1%1cm,280nm (mg/ml)

  (Q 1%濃度»10mg/ml)

  2.280nm和260nm的接收差法

  核酸對紫外光有很強的接收,在280nm處的接收比卵白質強10倍(每克),但核酸在260nm處的接收更強,其接收岑嶺在260nm四周。核酸260nm處的消光系數是280nm處的2倍,而卵白質則相反,280nm紫外接收值大于260nm的接收值。凡是:

  純卵白質的光接收比值:A280/A260 » 1.8

  純核酸的光接收比值: A280/A260 » 0.5

  含有核酸的卵白質溶液,可別離測定其A280和A260,由此接收差值,用上面的經歷公式,便可算出卵白質的濃度。卵白質濃度=1.45×A280-0.74×A260 (mg/ml)

  此經歷公式是經由過程一系列已知差別濃度比例的卵白質(酵母烯醇化酶)和核酸(酵母核酸)的夾雜液所測定的數據來成立的。

  3.215nm與225nm的接收差法

  卵白質的稀溶液因為含量低而不能利用280nm的光接收測定時,可用215nm與225nm接收值之差,經由過程規范曲線法來測定卵白質稀溶液的濃度。

  用已知濃度的規范卵白質,配制成20~100 mg/ml的一系列5.0ml的卵白質溶液,別離測定215nm和225nm的吸光度值,并計較出接收差: 接收差D= A215 -A225

  以接收差D為縱座標,卵白質濃度為橫座標,繪出規范曲線。再測出未知樣品的接收差,便可由規范曲線上查出未知樣品的卵白質濃度。

  本方式在卵白質濃度20~100mg/ml規模內,卵白質濃度與吸光度成反比,NaCl、(NH4)2SO4和0.1M磷酸、硼酸和Tris等緩沖液,都無明顯攪擾感化,可是0.1N NaOH,0.1M乙酸、虎魄酸、鄰苯二甲酸、巴比妥等緩沖液的215nm光接收值較大,必須將其濃度降到0.005M以下才無明顯影響。

  4.肽鍵測定法

  卵白質溶液在238nm處的光接收的強弱,與肽鍵的幾多成反比。是以能夠用規范卵白質溶液配制一系列50~500mg/ml已知濃度的5.0ml卵白質溶液,測定238nm的光接收值A238,以A238為縱座標,卵白質含量為橫座標,繪制出規范曲線。未知樣品的濃度便可由規范曲線求得。

  停止卵白質溶液的柱層析分手時,洗脫液也能夠用238nm檢測卵白質的峰位。

  本方式比280nm接收法活絡。但多種無機物,如醇、酮、醛、醚、無機酸、酰胺類和過氧化物等都有攪擾感化。以是最好用無機鹽,無機堿和水溶液停止測定。若含有無機溶劑,可先將樣品蒸干,或用其余方式撤除攪擾物資,而后用水、稀酸和稀堿消融后再作測定。