1 貯存溫度

　　生物樣本的持久貯存凡是操縱盡能夠或許或許低的溫度來降落樣本內的生化反映進步樣本內各類成份的不變性。生物大份子、細胞、構造和器官的經常操縱貯存溫度有-800C(超高溫冰箱), -1400C(液氮氣相或深冷冰箱)和-1960C(液氮液相)，溫度越低樣本的不變保管時候越長。0～-600C是水的結晶溫度，輕易對細胞和構造的微觀布局構成危險，普通不操縱這一溫度來保管構造和細胞。局部顛末提純的生物大份子能夠或許或許在0～-600C不變保管必然時候，但在構造樣本內生物大份子遭到細胞構造內多種身分的影響，不變性有能夠或許或許較著降落，以是凡是樣本庫不操縱0～-600C作為貯存溫度。

　　-800C樣本貯存

　　-800C低于危險性較大的水的結晶溫度規模，也是經常操縱裝備超高溫冰箱能到達的溫度，基于操縱簡潔性、貯存量和本錢等身分來考量，這一溫度也是今朝保管樣本中生物大份子活性的經常操縱溫度。但對差別的生物大份子活性這一溫度下能堅持多久仍無定論。構造中DNA的不變性能夠或許或許在-800C下能夠或許或許堅持數年或更永劫候。但對RNA來講，則輕易被遍及散布于細胞和各類構造里的RNA酶逐步降解，在差別的細胞和構造中，RNA不變貯存的時候長短也有較大的區分，但普通不跨越5年，在一些敏感嘗試內，RNA在-800C下不到一年就發生了測得出的降解，以是為持久保管RNA活性，倡議操縱更低的溫度，或操縱小局部樣本提取RNA與殘剩樣本同步貯存。其余樣本內的卵白質和脂類等生物大份子在樣本內涵-800C下也能保管，但時候長短不一，不變性逐步衰減。若是為掩護樣本里已知的特定生物大份子，也可插手該份子的不變劑。若是樣本里要保管的生物大份子不決，倡議操縱更低的溫度貯存。別的今朝罕見的大型主動化樣本存取裝備只能和-800C超高溫裝備配套操縱，尚不能夠或許或許和液氮裝備配套操縱。英國的UK Biobank則是把一局部樣本的拷貝(～950萬)貯存在-800C做任務樣本，操縱主動化裝備存;別的一局部拷貝(～550萬)在別的一個處所貯存在液氮氣相中做寧靜備份，樣本手動存取。

　　-1400C樣本貯存

　　-1400C是低于水的玻璃化溫度(～-1360C)，也是液氮氣相和深冷冰箱能夠或許或許到達的溫度，樣本在這一溫度規模內其生物學勾當極大降落，是保管樣本中細胞活性的抱負溫度。和冰水夾雜物能堅持在00C的相變溫度近似，絕緣的液氮容器內液相和藹相氮應當堅持在相變溫度-1960C。但現實上因為液氮容器蓋子不夠密封，從而致使在液氮液面和液氮容器罐口之間構成一個溫度梯度。美國國度癌癥研討所倡議液氮容器口處的溫度應堅持在-1400C以下，未來用處未肯定的樣本應以液氮氣相情勢貯存，以掩護構造內細胞活性。

　　深冷冰箱是電制冷，無需液氮，裝滿樣品后的不變溫度凡是在-140以下，和操縱液氮氣比擬擬，其上風在于不需頻仍增添液氮，掩護便利。但電制冷的降溫速度低于液氮，一旦開啟容器取放樣品時輕易構成較大規模的溫度動搖，溫度規復時候也絕對較長，是以更合適較少開啟取放樣品的環境。別的電制冷冰箱必須保證供電。在斷電環境下保舉操縱液氮裝備以供給備份貯存。

　　-1960C樣本貯存

　　-1960C是液氮揮發的溫度，是以只要液氮液相保管手藝能到達此溫度。樣本內的性命勾當在此溫度下根基遏制，樣本的不變性能夠或許或許取得持久的保管。是持久保管樣本內細胞活性、構造器官的龐雜布局及活性的最有用方式，取得遍及承認。與別的差別溫度冷凍情勢比擬，液氮容器液相貯存樣品須要進一步防護樣品間穿插凈化。美國國度癌癥研討所保舉操縱帶螺旋的凍存管封裝樣本。但在降溫進程中樣品從超高溫冰箱(-800C)轉移到液氮中時突然降溫，引發凍存管帽和管身縮短不分歧，輕易致使液氮滲入凍存管從而增添了樣品間穿插凈化的危險。處置的方式之一是能夠或許或許操縱特地的凍存管套對每一個凍存管停止熱縮密封，或是操縱密封膜在凍存管帽與管身接口處纏2-3圈再貯存。前一種方式會使管身加長而須要較高的凍存盒，第二種方式會使管身略變粗，保舉操縱底部距離的10x10規格的慣例凍存盒。

　　2 冷凍手藝

　　上世紀50-70年月Basil Luyet，James Lovelock，Peter Mazur等學者針對冷凍對細胞和構造的影響睜開深切研討，發明毀傷首要來歷于冰晶毀傷和溶液滲入壓毀傷。跟著溫度的降落，細胞表里的水份結冰，所構成的冰晶會構成細胞膜和細胞壁粉碎，從而致使細胞滅亡。這類因細胞內部結冰而引發的細胞毀傷即冰晶毀傷(Intracellular ice damage)。冰晶毀傷是由冷卻速度過快構成，冷卻速度越快，冰晶毀傷越大。同時跟著溫度的降落，細胞內部的水份會先結冰，從而使得未結冰的溶液中電解質濃度下降，細胞膜上的脂質會因永劫問裸露在高溶質的溶液中而遭到破壞，細胞發生脫水滲漏，致使在復溫時大批水份滲入細胞內構成細胞滅亡。這類因保管溶液溶質濃度增高而構成的細胞毀傷被稱為溶液毀傷(Solution damage)。溶液毀傷是由冷卻速度過慢，使細胞在高濃度的溶液中裸露的時候太長而構成，冷卻速度越慢，此毀傷越嚴峻。

　　法式降溫/分步降溫(programmed freezing/stepwise freezing)

　　經由進程節制樣本的降溫速度能夠或許或許盡能夠或許削減冰晶毀傷和溶液毀傷。降溫速度的節制可經由進程在差別的溫度下分階段降溫(stepwise freezing)或法式節制降溫(programmed freezing)完成。與分步降溫比擬，法式降溫儀經由進程不時調理往凍存空間噴放液氮的流量能更精準地節制樣本自身的降溫速度。比方在0—-50C液體樣本改變為固體發生相變時會發生熱量，引發樣本的回溫，構成樣本額定危險。法式降溫儀能夠或許或許在相變時加大降溫力度防止這一危險。法式降溫儀在凍存精子、卵子、受精卵、干細胞、皮膚等樣本中取得了遍及的利用，環球約莫有30-40萬體外受精的嬰兒操縱了這一方式。一個凍存法式凡是包含慢凍、快凍等幾個階段，在凍存掩護劑存在的環境下罕見的凍存速度慢凍0.3-1.50C/分鐘,快凍5-80C/分鐘。在0～-400C的區間不少法式操縱的是慢凍。但詳細的降溫法式隨凍存樣本的差別能夠或許或許有較大的差別。

　　玻璃化冷凍(Vitrification)

　　玻璃化冷凍的實際起首由Luyet提出。液體的凝結可分為兩種情勢：一種是晶體化，溶液中的份子呈有序擺列;別的一種環境長短晶體即玻璃化，液體中的份子呈無序狀況，堅持未凝結前的狀況。 普通冷凍時水輕易在細胞內構成晶體構成晶體毀傷，在細胞外構成晶體構成溶液毀傷。但在超疾速玻璃化冷凍的前提下細胞表里均呈玻璃化凝結，無冰晶構成或僅構成很小的冰晶，不致對細胞膜和細胞器不致構成毀傷，細胞也不會在高濃度的溶質中永劫候裸露而受損。但玻璃化冷凍所須要的超的高速降溫很難在慣例嘗試前提下完成。1981年Fahy提出用高濃度的冷凍掩護液(玻璃化溶液)的方式大大降落了對降溫速度的請求，并與1985年由Rail和Fahy完成鼠胚的玻璃化凍存，完成這一手藝的操縱沖破。

　　玻璃化冷凍是一種較新的手藝，合適用于一些慣例法式降溫難以處置的樣本，比方龐雜的構造和器官。但對慣例法式降溫能夠或許或許較好處置的樣本(如細胞和體積很小的構造)，這一手藝還不揭示出出格的上風。普通的水的玻璃化冷凍須要極快的速度，是慣例嘗試室難以完成的。為了降落構造的玻璃化降溫請求，須要在樣品中插手高濃度的冷凍掩護劑，經常操縱的濃度約在40%～60%(W/V)。即便是幾分鐘的時候也會對細胞和構造會帶來較著的危險。以是固然玻璃化冷凍削減了冷凍進程的冰晶危險和溶液危險，但在一些對照嘗試并不表現出更好的結果，反倒是其龐雜的操縱帶來了方便。今朝在玻璃化冷凍中，降落冷凍掩護劑毀傷的方式首要是操縱差別冷凍掩護劑的夾雜物和阻冰劑(ice blockers)。經由進程這一改良，Twenty-First Century Medicine勝利將冷凍并化凍的兔腎移植到兔子體內并堅持了普通功效。

　　急凍(Snap freezing)

　　急凍法凡是用于掩護純化的生物大份子，或為了未來提取生物大份子的構造樣本。做法是將樣本間接放入液氮中，短時候處置以后轉移至超高溫冰箱或更低的溫度環境貯存。比擬罕見的例子是冷凍用于未來提取核酸的構造。這類做法會毀傷大局部細胞和邃密構造布局，不能用于保管樣本內細胞和構造的活性。

　　3 冷凍掩護劑

　　冷凍掩護劑是指能夠或許或許掩護細胞和構造微觀布局免受冷凍毀傷的物資，凡是配成必然濃度的溶液。細胞懸液中插手冷凍掩護劑可掩護細胞免受溶液毀傷和冰晶毀傷。冷凍掩護劑同溶液中的水份子連系，發生水協感化，弱化水的結晶進程使溶液的粘性增添從而削減冰晶的構成.同時冷凍掩護劑能夠或許或許經由進程在細胞表里堅持必然的摩爾濃度，降落細胞表里未結冰溶液中電解質的濃度，使細胞免受溶質的毀傷。凡是只要紅細胞、大大都微生物和少大都有核的哺乳植物細胞懸浮在不加冷凍掩護劑的水或簡略的鹽溶液中，并以最適的冷凍速度冷凍，能夠或許或許取得活的凍存物。但對大大都有核哺乳植物細胞來講，在不加冷凍掩護劑的環境下，無最適冷凍速度可言，也不能取得活的冷凍物。比方將小鼠骨髓細胞懸浮在不加冷凍掩護劑的均衡鹽溶液中，并以0.3～6000C/min的冷凍速度降溫冷凍，98%以上的細胞會滅亡;而插手甘油冷凍掩護劑停止冷凍保管時，98%以上的細胞都可存活。

　　冷凍掩護劑按照其是不是穿透細胞膜可分為滲入性和非滲入性兩類。滲入性冷凍掩護劑多是一些小份子物資，能夠或許或許透過細胞膜滲入到細胞內。該類掩護劑首要包含二甲基亞砜(Dimethyl Sulfoxide，DMSO)、甘油、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。其掩護機制是在細胞冷凍懸液完整凝結之前，滲入到細胞內，在細胞表里發生必然的摩爾濃度，降落細胞表里未結冰溶液中電解質的濃度，從而掩護細胞免受高濃度電解質的毀傷同時，細胞內水份也不會過度外滲，防止了細胞過度脫水舒展。今朝操縱較多的是DMSO、甘油、乙二醇和丙二醇等。DMSO對細胞的滲入較快，凍存進程中掩護結果較好，操縱比擬遍及，經常操縱濃度是5%-10%。但DMSO自身對細胞有較著的危險，在40C的溫度下危險尤甚，是以不倡議樣本增添DMSO后在此溫度下永劫候安排，凡是與法式降溫儀或梯度降溫盒共同操縱完成溫度持續勻速降落。

　　非滲入性冷凍掩護劑不能滲入到細胞內，普通是些大份子物資，首要包含聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白卵白和羥乙基淀粉等。其掩護機制的假說良多，此中有一種能夠或許或許是，聚乙烯吡咯烷酮等大份子物資能夠或許或許優先同溶液中水份子連系，降落溶液中自在水的含量，使冰點降落，削減冰晶的構成;同時，因為其份子量大，使溶液中電解質濃度降落，從而加重溶質毀傷。

　　差別的冷凍掩護劑有差別的優錯誤謬誤。今朝的趨向是結合操縱兩種以上冷凍掩護劑組合。因為很多冷凍掩護劑在高溫前提下掩護細胞，在常溫下對細胞無害。故在細胞復溫后要實時斷根冷凍掩護劑。