高效液相色譜法是在典范色譜法的根本上，援用了氣相色譜的現實，在手藝上，活動相改成高壓保送(最高保送壓力可達4.9´107Pa);色譜柱是以出格的方式用小粒徑的填料添補而成，從而使柱效大大高于典范液相色譜(每米塔板數可達幾萬或幾十萬);同時柱后連有高活絡度的檢測器，可對流出物停止持續檢測。

　　特色1。高壓：液相色譜法以液體為活動相(稱為載液)，液體流經色譜柱，遭到阻力較大，為了敏捷地經由進程色譜柱，必須對載液施加高壓。通俗可達150～350×105Pa。

　　2. 高速：活動相在柱內的流速較典范色譜快很多，通俗可達1～10ml/min。高效液相色譜法所需的闡發時候較之典范液相色譜法少很多，通俗少于 1h 。

　　3. 高效：邇來研討出很多新型牢固相，使分手效力大大進步。

　　4.高活絡度：高效液相色譜已普遍接納高活絡度的檢測器，進一步進步了闡發的活絡度。如熒光檢測器活絡度可達10-11g。別的，用樣量小，通俗幾個微升。

　　5.順應規模寬：氣相色譜法與高效液相色譜法的比擬：氣相色譜法雖具備分手才能好，活絡度高，闡發速率快，操縱便利等長處，但是受手藝前提的限定，沸點太高的物資或熱不變性差的物資都難于利用氣相色譜法停止闡發。而高效液相色譜法，只需求試樣能制成溶液，而不須要氣化，是以不受試樣揮發性的限定。對高沸點、熱不變性差、絕對份子量大(大于 400 以上)的無機物(這些物資幾近占無機物總數的 75% ～ 80% )準繩上都可利用高效液相色譜法來停止分手、闡發。 據統計，在已知化合物中，能用氣相色譜闡發的約占20%，而能用液相色譜闡發的約占70～80%。

　　高效液相色譜按其牢固相的性子可分為高效凝膠色譜、疏水性高效液相色譜、反相高效液相色譜、高效離子互換液相色譜、高效親和液相色譜和高效聚焦液相色譜等范例。用差別范例的高效液相色譜分手或闡發各類化合物的事理根基上與絕對應的通俗液相層析的事理近似。其差別的地方是高效液相色譜活絡、疾速、分辯率高、反復性好，且須在色譜儀中停止。

　　高效液相色譜法的首要范例及其分手事理

　　按照分手機制的差別，高效液相色譜法可分為下述幾種首要范例：1 。液 — 液分派色譜法Liquid-liquid Partition Chromatography及化學鍵合相色譜Chemically Bonded Phase Chromatography活動相和牢固相都是液體。活動相與牢固相之間應互不相溶(極性差別，防止牢固液散失)，有一個較著的分界面。當試樣進入色譜柱，溶質在兩相間停止分派。到達均衡時，從命于下式：

　　式中，cs—溶質在牢固相中濃度;cm--溶質在活動相中的濃度; Vs—牢固相的體積;Vm—活動相的體積。LLPC與GPC有近似的地方，即分手的挨次取決于K，K大的組分保留值大;但也有差別的地方，GPC中，活動絕對K影響不大，LLPC活動絕對K影響較大。

　　a. 正相液 — 液分派色譜法Normal Phase liquid Chromatography: 活動相的極性小于牢固液的極性。

　　b. 反相液 — 液分派色譜法Reverse Phase liquid Chromatography: 活動相的極性大于牢固液的極性。

　　c. 液 — 液分派色譜法的錯誤謬誤：雖然活動相與牢固相的極性請求完整差別，但牢固液在活動相中仍有微量消融;活動相經由進程色譜柱時的機器打擊力，會組成牢固液散失。上世紀70年月末成長的化學鍵合牢固相(見后)，可降服上述錯誤謬誤。此刻利用很普遍(70~80%)。

　　液 — 固色譜法活動相為液體，牢固相為吸附劑(如硅膠、氧化鋁等)。這是按照物資吸附感化的差別來停止分手的。其感化機制是：當試樣進入色譜柱時，溶質份子 X 和溶劑份子S對吸附劑外表活性中間產生合作吸附(未進樣時，一切的吸附劑活性中間吸附的是S)，可表現以下：Xm nSa ====== Xa nSm式中：Xm--活動相中的溶質份子;Sa--牢固相中的溶劑份子;Xa--牢固相中的溶質份子;Sm--活動相中的溶劑份子。

　　當吸附合作反映達均衡時：K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa]式中：K為吸附均衡常數。[會商：K越大，保留值越大。]3 。離子互換色譜法Ion-exchange ChromatographyIEC是以離子互換劑作為牢固相。IEC是基于離子互換樹脂上可電離的離子與活動相中具備不異電荷的溶質離子停止可逆互換，按照這些離子以互換劑具備差別的親和力而將它們分手。

　　以陰離子互換劑為例，其互換進程可表現以下：X-溶劑中 樹脂-R4N Cl-=== 樹脂-R4N X- Cl- 溶劑中當互換達均衡時：KX=[-R4N X-][ Cl-]/[-R4N Cl-][ X-]分派系數為：DX=[-R4N X-]/[X-]= KX [-R4N Cl-]/[Cl-][會商：DX與保留值的干系]但凡在溶劑中能夠電離的物資凡是都能夠用離子互換色譜法來停止分手。

　　4 。離子對色譜法Ion Pair Chromatography離子對色譜法是將一種 或多種 與溶質份子電荷相反的離子 稱為對離子或反離子 加到活動相或牢固相中，使其與溶質離子連系組成疏水型離子對化合物，從而節制溶質離子的保留行動。其事理可用下式表現：X 水相 Y-水相 === X Y-無機相式中：X 水相--活動相中待分手的無機離子(也但是陽離子);Y-水相--活動相中帶相反電荷的離子對(如氫氧化四丁基銨、氫氧化十六烷基三甲銨等);X Y---組成的離子對化合物。

　　當達均衡時：KXY = [X Y-]無機相/[ X ]水相[Y-]水相按照界說，分派系數為：DX= [X Y-]無機相/[ X ]水相= KXY [Y-]水相[會商：DX與保留值的干系]離子對色譜法出格是反相發處置了以往難以分手的夾雜物的分手題目，諸如酸、堿和離子、非離子夾雜物，出格是一些生化試樣如核酸、核苷、生物堿和藥物平分手。

　　5 。離子色譜法Ion Chromatography用離子互換樹脂為牢固相，電解質溶液為活動相。以電導檢測器為通用檢測器，為消弭活動相中強電解質背景離子對電導檢測器的攪擾，設置了按捺柱。試樣組分在分手柱和按捺柱上的反映事理與離子互換色譜法不異。

　　以陰離子互換樹脂(R-OH)作牢固相，分手陰離子(如Br-)為例。當待測陰離子Br-隨活動相(NaOH)進入色譜柱時，產生以下互換反映(洗脫反映為互換反映的逆進程)：

　　按捺柱上產生的反映：R-H Na OH- === R-Na H2OR-H Na Br- === R-Na H Br-可見，經由進程按捺柱將洗脫液轉變成了電導值很小的水，消弭了本底電導的影響;試樣陰離子Br-則被轉化成了響應的酸H Br-，可用電導法活絡的檢測。

　　離子色譜法是溶液中陰離子闡發的最好方式。也可用于陽離子闡發。

　　6 。空間排阻色譜法Steric Exclusion Chromatography空間排阻色譜法以凝膠 gel 為牢固相。它近似于份子篩的感化，但凝膠的孔徑比份子篩要大很多，通俗為數納米到數百納米。溶質在兩相之間不是靠其彼此感化力的差別來停止分手，而是按份子巨細停止分手。分手只與凝膠的孔徑散布和溶質的活動力學體積或份子巨細有關。試樣進入色譜柱后，隨活動相在凝膠內部空隙和孔穴旁流過。在試樣中一些太大的份子不能進入膠孔而遭到排阻，是以就間接經由進程柱子，起首在色譜圖上呈現，一些很小的份子能夠進入一切膠孔并滲入到顆粒中，這些組分在柱上的保留值最大，在色譜圖上最初呈現。

　　高效液相色譜儀首要有進樣體系、輸液體系、。分手體系、檢測體系和數據處置體系，上面將別離論述其各自的組成與特色。

　　1。進樣體系通俗接納隔閡打針進樣器或高壓進樣間實現進樣操縱，進樣量是恒定的。這對進步闡發樣品的反復性是無益的。

　　2。輸液體系該體系包含高壓泵、活動相儲存器和梯度儀三部分。高壓泵的通俗壓強為l。47～4。4X107Pa，流速可調且不變，當高壓活動相經由進程層析柱時，可下降樣品在柱中的分散效應，可加快其在柱中的挪動速率，這對進步分辯率、收受接收樣品、堅持樣品的生物活性等都是無益的。活動相儲存錯和梯度儀，能夠使活動相隨牢固相和樣品的性子而轉變，包含轉變洗脫液的極性、離子強度、PH值，或改用合作性按捺劑或變性劑等。這便能夠使各類物資(即便唯一一個基團的差別或是同分異構體)都能取得有用分手。

　　3.分手體系該體系包含色譜柱、毗連管和恒溫器等。色譜柱通俗長度為10～50cm(須要兩根連用時，可在兩者之間加一毗連管)，內徑為2～5mm，由"優良不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等資料制成，住內裝有直徑為5～10μm粒度的牢固相(由基質和牢固液組成)。牢固相中的基質是由機器強度高的樹脂或硅膠組成，它們都有惰性(如硅膠外表的硅酸基因根基已撤除)、多孔性(孔徑可達1000?)和比外表積大的特色，加上其外表顛末機器涂漬(與氣相色譜中牢固相的制備一樣)，或用化學法偶聯各類基因(如磷酸基、季胺基、羥甲基、苯基、氨基或各類長度碳鏈的烷基等)或配體的無機化合物。是以，這類牢固絕對布局差別的物資有杰出的挑選性。比方，在多孔性硅膠外表偶聯豌豆凝固素(PSA)后，就能夠把成纖維細胞中的一種糖卵白分手出來。

　　別的，牢固相基質粒小，柱床極易到達平均、致密狀況，極易下降渦流分散效應。基質粒度小，微孔淺，樣品在微孔區內傳質短。這些對減少譜帶寬度、進步分辯率是無益的。按照柱效現實闡發，基質粒度小，塔板現實數N就越大。這也進一步證實基質粒度小，會進步分辯率的事理。

　　再者，高效液相色譜的恒溫器能夠使溫度從室溫調到60C，經由進程改良傳質速率，延長闡發時候，便可增添層析柱的效力。

　　4。檢測體系高效液相色譜經常利用的檢測器有紫外檢測器、示差折光檢測器和熒光檢測器三種。

　　(1)紫外檢測器該檢測器合用于對紫外光(或可見光)有接收機能樣品的檢測。其特色：利用面廣(如卵白質、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均能夠利用);活絡度高(檢測上限為10-10g/ml);線性規模寬;對溫度和流速變更不敏感;可檢測梯度溶液洗脫的樣品。

　　(2)示差折光檢測器凡具備與活動相折光率差別的樣品組分，均能夠利用示差折光檢測器檢測。今朝，糖類化合物的檢測大多利用此檢測體系。這一體系通用性強、操縱簡略，但活絡度低(檢測上限為10-7g/ml)，活動相的變更會引發折光率的變更，是以，它既不合用于痕量闡發，也不合用于梯度洗脫樣品的檢測。

　　(3)熒光檢測器凡具備熒光的物資，在必然前提下，其發射光的熒光強度與物資的濃度成反比。是以，這一檢測器只合用于具備熒光的無機化合物(如多環芳烴、氨基酸、胺類、維生素和某些卵白質等)的測定，其活絡度很高(檢測上限為10-12～10-14g/ml)，痕量闡發和梯度洗脫作品的檢測都可接納。

　　(5)數據處置體系該體系可對測試數據停止收羅、儲存、顯現、打印和處置等操縱，使樣品的分手、制備或判定任務能準確展開。