反相色譜是迄今在高效液相色譜中操縱最廣泛的手藝，首要是因為它合用于闡發極大大都的非極性物資和良多的可離子化的及離子化合物。大大都用于反相色譜的牢固相都是自然的疏水物資。

　　牢固相上另有多數物資，如夾雜相(比方苯基-己基)、結尾封鎖和非結尾封鎖品種和極性嵌入相-也存在于這些鍵合硅膠上。另有良多填料用于反相色譜，包含聚合物，聚合物外表涂上硅膠和氧化鋁，無機-無機夾雜物，涂層氧化鋯，和石墨化碳。差別品種的牢固相有他們本身的長處和錯誤謬誤。

　　反相色譜柱操縱各類活動相和增添物能夠有良多的操縱。一些手藝操縱增添物能夠轉變或潤色填料的外表。偶然候這些增添物有能夠會凈化鍵合相外表。

　　硅膠外表因為有著疏水鍵合相而有一些別的化學性子。殘留的硅烷醇存在于一切的硅膠鍵合填猜中。這些硅烷醇具備弱酸性，是以能與某些待闡發物合基質成份，出格是堿性成份。因為硅烷醇的 pKa 值約莫是 4.5 ，離子化能在中性 pH 前提下發生是以與陽離子發生靜電彼此感化就有能夠發生。較老的 A 型硅膠能包容高濃度金屬離子(偶然候 100ppm 或更多)，而這能使硅膠外表的酸性更大乃至能發生金屬鰲合景象或斷根一些化合物。殘留硅烷醇在非結尾封鎖的硅膠合短鏈鍵合相如 C2 或 C4 上更讓人懊惱。

　　操縱者必須清晰他們所用的牢固相外表特別性子和能夠的闡發物-牢固相外表的彼此感化，如許當他們操縱反相方式時能力斟酌到能夠的基質彼此感化。比方，很是疏水的樣品基質如玉米油，高芬芳物資，和蠟能粘住牢固相裝填外表并且轉變他們的性子。含有卵白質物資的生物流體也能吸附在裝填外表。雖然闡發者想盡最大盡力來掩護 HPLC 柱子，某些闡發物-基質凈化能使牢固相遭到無害的影響。

　　當柱子被凈化，它的色譜行動和沒被凈化的柱子會有些差別。被凈化的柱子能發生反壓題目。 被凈化的反相柱子必須洗濯和再生能力規復本來的操縱前提。這局部的 " 柱子察看 " 將會商可行的方式使柱子答復本來的或差未幾本來的狀況。因為鍵合硅膠柱子是最受接待的，我重點報告這類柱子。最初，我將會商別的反相柱子的潔凈步驟。

　　甚么致使反相柱子凈化發生?凡是，樣品中含有一些對闡發者來講不感樂趣的工具。鹽、脂質、含脂物資、腐質酸、疏水卵白質和別的一些生物物資是一些能夠在操縱時與 HPLC 柱發生彼此感化的物資。這些物資有比闡發者的方針物或少或大的保留值。那些保留值較小的物資如鹽類普通來講在空體積時就被沖出色譜柱。這些非方針產品的攪擾能被檢測器檢測到并且能構成色譜峰，氣泡，基線上移或是負峰。若是樣品成份在柱子中有很強的保留并且活動相溶液成份缺乏以把這些物資洗脫上去，屢次上樣后，這些吸附在柱子外表的物資凡是就會堆集在柱頭。這些行動凡是只要經由進程平行嘗試能力發明。有著中等保留值的樣品能被遲緩洗出并且表現為寬峰，基線擾動，或基線漂移。

　　偶然候這些被吸附的樣品成份積累到必然水平足以使他們起頭構成新的牢固相。闡發物能與這些雜質感化構成必然的分手機理。保留時辰會動搖，拖尾會呈現。若是充足的凈化發生，柱子的反壓能跨越泵所能蒙受的最大壓力，使柱子沒法任務和在梗塞處發生空體積。

　　洗濯硅膠鍵合柱子 再生被凈化 HPLC 柱子的關頭是曉得凈化物的性子并且能找到恰當的溶劑來去除。若是凈化是因為反復進樣時強保留物資的積累引發的，操縱簡略的步驟來撤除這些凈化物常常能規復其色譜行動。偶然候，顛末屢次操縱今后的色譜柱用 90 ～ 100 %的溶劑 B (雙溶劑反相體系中較強的溶劑)沖刷 20 個別積能夠斷根凈化物。(表 2 羅列了差別規格的 HPLC 柱子的空體積，是以讀者能便利地肯定響應柱子沖刷的體積。)比方，柱子中殘留的脂質就能用非水溶劑如甲醇、乙晴、四氫呋喃。若是你操縱的是緩沖液體系，不要間接切換到強溶劑，俄然轉換到高濃度無機溶劑能夠會使 HPLC 活動體系中的緩沖液積淀，如許會致使更大的題目如柱頭梗塞、管道梗塞、泵泄露、活塞毀傷或進樣閥轉軸失靈。應當先用無緩沖活動相(即把緩沖液換成水)。沖刷 5 ～ 10 個別積今后才改換強溶劑。

　　偶然候，強溶劑也沒法把殘留在色譜柱上的凈化物洗掉。那末更強的溶劑或是一系列溶劑就有須要用來洗濯柱子樂，若是凈化物長短生物物資，操縱者能夠跳過一個或多個別的的無機溶劑去除凈化物。溶劑與溶劑之間的組合有良多。到柱子廠家的網頁上能找到保舉的溶劑體系。

　　普通來講，一切的洗濯方式都有近似的情勢。所用的溶劑都是隨溶劑強度增添，常常最初一個溶劑是很是疏水的(如醋酸乙酯乃至是烴)，能夠用來消融非極性物資如脂質和油類。咱們必須保障一系列溶劑中每個溶劑都能與下一個溶劑互混。洗濯進程要竣事時，必須借助一個中等強度能互混的溶劑而回到原始溶劑體系。比方，異丙醇是一個很是好的作為中間步驟的溶劑，因為它能與正己烷或二氯甲烷互溶又能與水相溶劑互溶。可是異丙醇粘度很是大，必須確保較低的流速以防止使泵壓太高。固然，若是操縱紫外檢測器的話，防止溶劑在紫外地區有接收，要不然需操縱大批的溶劑沖刷能力使基線安穩。

　　對典范的硅膠鍵合柱來講若是不緩沖溶液的話保舉操縱以下溶劑系列： 100 %甲醇

　　100 %乙晴

　　75 %乙晴- 25 %異丙醇

　　100 %異丙醇

　　100 %二氯甲烷

　　100 %正己烷 用二氯甲烷或正己烷今后，因為溶劑相容性柱子必須用異丙醇沖刷后能力用本來的水相溶劑。每種溶劑最少沖刷 10 個柱體積。如 250mm × 4.6mmHPLC 闡發柱，闡發者能夠用 1 ～ 2ml/min 的流速來沖刷，要答復本來的溶劑體系，不須要每步都沖刷，能夠跳過中間步驟。中間步驟保舉操縱異丙醇，而后用不緩沖的活動相，最初答復肇端活動相設置裝備擺設。四氫呋喃是別的一種比擬受接待的去除凈化的溶劑。若是操縱者思疑柱子被嚴峻凈化，能夠二甲基亞砜( DMSO )或二甲基甲酰銨和水按 50 ： 50 的比例夾雜用低于 0.5ml/min 的流速流過色譜柱。勝利再生反相柱子是一個很是耗時辰的進程，溶劑沖刷能夠操縱梯度體系留宿操縱。