流式細胞術(flowcytometry FCM)是對單個細胞或其余生物微粒停止疾速定量闡發和分選的一門手藝。在闡發或分選進程中，包繞在活動液體中處置過的單個細胞或微粒經由進程聚焦的光源，發生電旌旗燈號，這些旌旗燈號代表光散射、熒光等參數，以此測定出細胞或微粒的物理和化學性子，并可按照這些性子分選出高純度的細胞亞群，以對其進一步的培育或闡發。包繞細胞的液流稱為鞘液。所用儀器稱為流式細胞儀(flowcytometer FCM)。流式細胞術綜合了光學、電子學、流體力學、細胞化學、免疫學、激光手藝和計較機迷信等多門學科和手藝，具備檢測速率快、切確、丈量目標多、收羅數據量大、闡發周全、體例矯捷等特色。

　　一、流式細胞儀(flowcytometer FCM)

　　1.流式細胞儀的根基布局

　　流式細胞儀的布局普通可分四局部。

　　(1)活動體系

　　活動體系是流式細胞儀的心臟，由于細胞懸液在被檢測之前必須起首構成一個很細的穩流，細胞在其外部排成單列經由進程丈量區。細胞懸液和鞘液別離(是別離仍是同時)進入活動室，鞘液的感化是使樣品懸液中的粒子構成單一縱列體例經由進程丈量區，保障每一個細胞經由進程激光照耀區的時候相稱，從而取得精確的細胞熒光信息。

　　(2)激光體系

　　多接納氬離子激光器。使發射光在可見光譜規模內488nm激起。今朝市場上大大都熒光色素合用于此波長。激光的單色性好，功率高，不變。

　　(3)光學和電子體系

　　激光束射至經流體力學聚焦的個體細胞和粒子后，光散射在各個標的目標(360?)發射。有兩個光散射參數需搜集，前向角散射(FSC)首要用于檢測細胞體積的巨細。

　　另外一為側向散射(SSC)用于檢測細胞膜，胞質，核膜等細胞外部布局及胞質內顆粒。

　　熒光旌旗燈號是由對細胞停止染色的特同性熒光染料遭到激光激起后發射的。熒光波長與激光波長差別，并且強度較弱，是以要操縱光學濾片濾除非熒光旌旗燈號并操縱活絡的檢測器。熒光丈量時凡是操縱線性縮小器(即縮小器的輸入與輸入是線性干系)，合用于較小規模內變更的旌旗燈號，如前向角散射和DNA丈量。但偶然須要對數縮小器(即輸入與輸入是對數干系)。若是本來輸入為1，當輸入增添到本來的10倍時，輸入是2。在免疫學檢測中常操縱對數縮小器，由于在免疫學的樣品中，可以或許或許有的細胞未被染色而獨一自覺熒光，為陽性群體;被染上色的細胞特同性熒光可以或許或許比自覺熒光強數倍到數十倍，為陽性群體。操縱對數縮小器可以或許或許同時分辯出亮度差別大的多個細胞亞群，輕易選定差別亞群間的分界點，有益于流式細胞儀的闡發和分選。

　　熒光旌旗燈號的彌補：當用一種激光束同時激起兩種染料發射出兩種差別波長的熒光時，兩種熒光發射光譜有必然的重迭，可用電彌補減去不合適熒光通道測定的重迭旌旗燈號。

　　(4)數據儲存和計較機節制體系

　　數據儲存接納列表列隊(List Mode)體例。操縱計較機用多種圖形來標明各參數間的彼此干系，以單參數直方圖，雙參數二維點圖，等高圖等體例顯現。數據闡發普通設定精確的闡發規模，分別計較地區和計較成果。

　　(5)細胞分選體系

　　細胞分選可以或許或許使被指定的細胞從細胞群體平分手出來。流式細胞儀所測定的任何參數都可以或許或許作為細胞分選按照，當選出來的細胞的均一性與所測參數有關。其任務道理是把液滴構成旌旗燈號在壓電晶體上使之發生機器振動(不太通暢)，液柱斷裂成一連串平均的液滴，一局部液滴中包有細胞，若是其特征與當選定要停止分選的細胞特征合適，則帶有特定的電荷。帶有電荷的液滴向下落入偏轉板的高壓靜電場時，偏轉落入指定的搜集器內，實現細胞分類搜集的目標。

　　2.流式細胞儀的范例

　　流式細胞儀分為兩大類，一類為臨床闡發型(別名臺式機)，特色為儀器光路調理體系牢固，主動化程度高，易學易把握。如Becton Dickinson(簡稱BD)公司的FACSCalibur、Beckman-Coulter公司的EPICSXL、Cytomation公司的MOFLO、Partec公司的Pas、Aber公司的Microcyte、Ortho公司Cytoron等;另外一類為科研(分選)型，特色為可疾速將所感樂趣的細胞分選出來，并且將單個或指定個數的細胞分選到特定的培育孔或板上，同時可選配多種波長范例的激光器，合用于更普遍的迷信研討之用。如BD公司的FACS Vantage，Beckman Coulter公司的EPICSALTRA，Cytomation公司的MOFLOMLS及Partec公司的Pas-III等。比來BD公司推出了FACSAria,其長處為具備科研分選型規范而操縱與臨床闡發型一樣簡潔，主動化程度高。

　　3.流式細胞儀檢測的品德節制

　　(1)樣品與試劑

　　血液、骨髓、體液等必須當天收羅，6 h以內停止免疫熒光染色;活化血小板檢測應在采血后當即染色與牢固。構造樣品可接納機器法去堆積并過濾，最好用單細胞制備儀(medimachine)處置。試劑、緩沖液、溶血劑、牢固劑等必須合適規范。

　　(2)對比設置

　　目標是防止各類身分可以或許或許構成的假陽性或假陽性反映。

　　①同型對比：與單克隆抗體(MoAb)不異的、未免疫小鼠標記熒光素的免疫球卵白亞類作對比。首要斟酌細胞的自覺熒光、非特同性抗體連系等影響身分。

　　②陽性對比：已知陽性標本可否肯定為陽性。達不到請求時不能停止臨床嘗試。

　　③陽性對比：用已知不抒發某種抗原的細胞作樣品檢測，應呈現陽性。目標是防止嘗試的非特同性反映。

　　④一般對比：對一種新的MoAb，在操縱前停止對比嘗試，可保障儀器在最好前提下取得樣品。

　　⑤質控品：

　　試劑廠方供給與待測樣品成份附近的不變的質控物，并供給檢測名目標靶值和質控規模，作為某一嘗試名目標全程品德檢測物，評價嘗試成果的靠得住性。如BDMulti-Check Control 是淋巴細胞及其亞群闡發的全血質控品。

　　(3)儀器的校準與機能檢測

　　操縱規范熒光微球，運轉FACSComp軟件，校準經由進程，標明儀器狀況杰出。

　　二、流式細胞儀的功效和臨床操縱

　　流式細胞儀最大的進獻在于增進了免疫學根本研討和臨床診斷。今朝流式細胞術已被普遍用于細胞生物學、免疫學、腫瘤學、血液學、病理學、遺傳學和臨床查驗等多學科范疇的根本和臨床研討。

　　1.流式細胞儀的功效

　　(1)細胞參量闡發

　　包含細胞巨細、外形、卵白熒光、氧化復原狀況，膜的布局、活動性、微粘度、膜電位，酶活性，鈣離子含量，pH值，染色質布局，DNA分解，堿基比例等。

　　(2)細胞表型闡發

　　從1982年正式以CD(clustor of differentiation) 來抒發(示)白細胞分解抗原。己肯定的CD序號從CDl一CD247，這些細胞外表分解抗原，可以或許或許將人體構造細胞分為T細胞、B細胞、髓樣細胞、血小板、NK細胞、粘附份子、內皮細胞，細胞因子受體/趨化性細胞因子受體、干細胞/祖細胞、碳水化合物/凝固素、 非譜系組共13系。CD抗原在細胞外表的取得和喪失在必然程度上反映細胞分解程度和功效狀況。研討CD的意思在于①懂得CD抗原份子本身的一些特征及其與免疫功效的干系;②熟悉和切磋CD抗原所抒發細胞的功效及其在疾病發生中的感化。

　　(3)細胞分選

　　這是FCM的一項首要功效，今朝FCM對細胞亞群的分選純度可以或許或許到達99%，除對特定的亞群加以分選外，還可以或許或許分出所須要的染色體加以闡發乃至能連系PCR體例加以擴增，這多用于研討中。

　　2.流式細胞儀檢測在臨床的操縱

　　流式細胞儀的功效決議了其在醫學范疇的首要位置，今朝在臨床上首要用于細胞表型闡發、造血系腫瘤診斷和分型、移植前配型及與免疫有關疾病闡發等。

　　(1)CD抗原與白細胞闡發

　　①T細胞

　　CD3+(注重上面CD份子的格局應分歧)：成熟T淋巴細胞，是判定T細胞的首要標記，判定細胞免疫狀況。

　　CD4+： T贊助/引誘細胞亞群

　　CD8+： T按捺/細胞毒亞群

　　CD4+ /CD8+比值：是免疫狀況標記的檢測目標，一般CD4+ /CD8+比值為1.2∽2.9,在腫瘤、免疫缺點病、病毒傳染、本身免疫病、器官移植后都有診斷、預后和醫治的指點代價，其比例降落與病變程度有關。

　　CD8+ /CD28+ 與CD8+ /CD28—：前者為細胞毒T細胞(Tc)，后者為按捺性T細胞(Ts)。

　　CD4+/CD25+ 與CD4+ /CD25—：前者為免疫調理性T細胞，后者為效應T細胞。

　　CD4+ /CD29+：贊助性引誘細胞，贊助B細胞發生抗體和引誘細胞介導的淋巴細胞消融感化，本身免疫性疾病可見增添。

　　CD4+ /CD 45RA+ 與CD4+ /CD 45Ro+：前者為原初細胞(naive cell)首要功效是引誘Ts細胞活化和贊助其功效活性。SLE、MS患者外周血CD4+ /CD 45RA+細胞削減，后者為影象細胞(memory cell)。

　　②B淋巴細胞：CD19+是總的B淋巴細胞特異抗原，判定體液免疫狀況。CD23+為IgE低親和力受體，散布于B淋巴細胞、嗜酸粒細胞上，增添與失常反映性疾病、腎病綜合癥、白血病等有關。

　　③NK淋巴細胞： CD3—/CD(16+56)+ 細胞表型。

　　④單核/巨噬細胞標記：CD14+細胞

　　(2)CD 抗原與血小板闡發

　　闡發單個血小板或血小板亞群膜糖卵白，是血小板膜糖卵白檢測闡發體例學上的嚴重成長，對后本性與取得性血小板膜糖卵白非常而至疾病的診斷，出格是評價血栓性疾病與血栓前狀況發生與成長進程中血小板的活化程度及其診斷、醫治、防備等具備出格首要的意思。FCM闡發血小板膜糖卵白體例簡潔、疾速、標本用量少、活絡度高、特同性強、成果精確，為血小板的根本和臨床研討供給了極新的手腕。

　　CD62p(P挑選素)是一種糖卵白，存在于血小板α顆粒和內皮細胞中。CD62p在體內或體外安慰后，即轉移至膜外表，巨核細胞也有抒發。CD62p又稱GMP—140或PADGEM卵白(血小板活化依靠α顆粒膜卵白)，它在血小板與單核細胞及中性粒細胞彼此感化中起關頭感化。

　　CD63為溶酶體膜糖卵白，在多種細胞的外表和胞漿內，出格是在血小板外部都能檢測到，血小板活化后即轉移至膜外表。

　　測血小板相干免疫球卵白(PAIg)包含抗IgG、IgM、IgA有助于診斷免疫性血小板削減癥。

　　一些血小板的胞漿中含有核酸物資RNA，可被噻唑橙(Thiazole orange,TO)染色稱網織血小板。網織血小板是剛從骨髓中開釋出來的血小板，可用于血小板削減性疾病的辨別診斷和療效監測。

　　3.贊助白血病和淋巴瘤分型和診斷

　　FCM是血液病MICC分型法中免疫表型闡發的首要手腕。免疫分型可為臨床指點醫治，判定預后，展望復發供給贊助。

　　(1)白血病系列分解抗原：

　　T淋巴細胞白血病：CD3、CD5、CD7、CD10

　　B淋巴細胞白血病：CDl9、CD20、CD21、CD22，CDl0

　　NK細胞白血病：CDl6、CD56、CD57

　　粒細胞白血病：CDl3、CD33、MPO(髓過氧化酶)

　　單核細胞白血病：CDl4、CDl5、 CDl1b

　　紅血病：血型糖卵白A(glycophorinA)，CDl3

　　巨核細胞白血病：CD41，CD42、CD61

　　(2)白血病系列非特同性抗原：

　　CD34+、HLA-DR+、CD38-為干細胞、CD34+、HLA-DR+、CD38+為原始細胞，CD34-、HLA-DR-、CD38+為老練細胞。

　　白血病細胞系列肯定后，可按照系列抗原抒發特色挑選單抗進一步分亞型。

　　4.HIV和取得性免疫缺點綜合征(AIDS)

　　HIV首要傳染CD4+T細胞，CD4+受體是病毒進入的首要路子。一般血中CD4+T細胞約1000細胞/ul(400---1500細胞/ul)。<400—500細胞/ul表現病毒激烈影響免疫體系。<200細胞/ul即便不病癥可肯定AIDS，有預后代價。HIV傳染初期CD8+T細胞增添，成長為AIDS則降落。

　　5.DNA含量闡發和細胞分解周期闡發

　　DNA含量檢測按照細胞周期能源學觀點，在一個周期內可分為4個時相，順次為G1期、S期、G2期和M期，見圖2。操縱DNA闡發軟件可以或許或許肯定各時相細胞的比例。可以或許或許停止DNA含量闡發的標本可以或許或許是PBL，一般、病變或腫瘤構造，針吸或活檢構造，白臘包埋構造，胸水、腹水，膀胱沖刷液和體外培育細胞。

　　DNA含量闡發的目標在于肯定某一構造或細胞群體的增殖狀況，引入DNA指數(D1)即DNA倍體的觀點可以或許或許用于辨別腫瘤的良惡性，惡性腫瘤的增殖狀況。

　　二倍體細胞的DI=1，在臨床上二倍體細胞DI在0.9—1.0之間，按照DI可以或許或許肯定細胞DNA倍體。

　　6.化療藥物用藥指點，敏感藥物挑選

　　藥物感化處置后的細胞接納Calcein-AM(Florescein-methylene aminodiacetic acid 熒光素亞甲亞氨二醋酸)與PI染色。Calcein-AM 為非熒光乙酰甲氨基酯經活細胞非特同性酯酶水解可變為熒光連系物，而死細胞不能水解因此無熒光。死細胞可被PI染成白色，活細胞不被PI染色，二者辨別較著，可用以挑選藥物。

　　7.實體器官移植配型和排異監測

　　可判定受者的免疫狀況、免疫按捺劑療效和滿身免疫按捺程度。移植前穿插配型檢測類抗原的抗體(PRA)、血管內皮細胞抗原(VEA)抗體，可以或許或許進步移植勝利率。

　　8.細胞凋亡(cell apoptosis)檢測

　　細胞凋亡可斷根體內無害的細胞群，保持內情況的不變。細胞凋亡說明一些疾病的病發機制，致使疾病新療法的呈現。FCM操縱光散射和熒光染色可以或許或許經由進程檢測細胞光散射轉變、膜布局和轉運功效轉變、DNA含量變更和DNA斷裂點標記，從多方面闡發和判定凋亡。是今朝可以或許或許同時辨別凋亡與壞死的獨一手腕。

　　碘化丙啶(P1)標記FCM闡發時，在細胞周期闡發圖中表現為G0/G1期峰前的亞G1期(sub-G1)峰。

　　位于細胞膜脂質雙層內側的磷脂酰絲氨酸(Ps)，反轉至外側是凋亡初期膜布局的特同性轉變。annexin-V是一種Ca2+依靠的磷脂連系卵白，與PS具備高親和力，以酶或熒光素標記的annexin-V為探針可判定凋亡，與PI連系經流式細胞儀(FCM)闡發，是獨一可辨別凋亡早、早期(若何辨別)與壞死的體例。見圖3。

　　9.Th1與Th2細胞及細胞因子

　　贊助性T細胞按照其發生的細胞因子及功效的差別可分為Th1與Th2兩大類。Th1細胞排泄IL-2、IFNγ、首要到場細胞免疫;Th2細胞排泄IL-4、IL-5、IL-6及IL-10，首要到場體液免疫。二者彼此調理、彼此均衡，其均衡平衡與多種疾病有關。操縱流式細胞儀可檢測細胞內細胞因子。

　　最近幾年來美國BD公司供給CBA(Cytometric bead array),接納一系列微珠組合來捕獲并連系流式細胞儀手藝檢測溶液中被檢測物資的量。此法長處為同時可檢測多名目標如人Th1/Th2 CBA可檢測IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNFα、IFNγ;人炎癥性細胞因子CBA可同時檢測IL-8、IL-1β、IL-6、IL-10、TNFα、和IL-12。

　　10.網織紅細胞計數

　　傳統手藝用煌焦油藍染料,染色涂片后,光鏡下計數,體例費時且只計數1000個細胞,偏差較大。操縱噻唑橙(Thiazole Orange, TO)染料,可與核酸構成熒光-核酸復合物,流式細胞儀上檢測50000個紅細胞求得百分率與絕對數,有助于血虛的辨別

　　11.造血干祖細胞檢測

　　骨髓移植的順應癥首要有白血病、后本性免疫缺點病、再障等。骨髓移植本色是造血干細胞的移植。CD34+細胞常作為多能干細胞的標記。

　　骨髓移植前檢測CD34+細胞是很首要的一個步驟。樣品經抗CD34+熒光抗體染色，可辨認和定量CD34+細胞。

　　12.糖皮質激素受體(glycocorticoid receptor,GCR)檢測

　　測GCR經常使用細胞溶質噴射配基受體(請確認)連系測定，它可定量，但需細胞量多、檢測時候長。流式細胞儀可測淋巴細胞總GCR，此法雖半定量，但檢測所需樣品量少。對持久激素醫治或肯定下丘腦-垂體-腎上腺皮質(HPA)軸功效雜亂，評價細胞內GCR程度有必然代價。

　　13.環氧合酶(Cyclooxygenase,COX)檢測

　　環氧合酶(COX)是花生四烯酸分解前線腺素(PG)的限速酶。它催化發生的PG到場機體多種心理和病理心理進程。COX有兩種范例:COX-1和COX-2。COX-1為布局性的“看家基因”產品,在大都構造細胞中延續低濃度抒發，到場保持機體一般的心理功效。COX-2為可引誘性的，炎癥、細胞因子、發展因子等安慰可以或許或許使其大批抒發，到場和減輕炎癥反映，增進腫瘤細胞增殖、重生血管構成，增進黏附、按捺免疫與按捺細胞凋亡。操縱流式細胞儀可監測人血單核細胞經LPS安慰后COX-2與COX-1的程度。對炎癥、血栓、腫瘤等病的病發機制、療效和預后判定均有必然代價。

　　最近幾年來操縱流式細胞術檢測特同性CTL細胞、細胞旌旗燈號傳導等亦在敏捷展開。