結晶紫法活性測定

　　1、取對數發展期的人胰腺癌SW1990細胞，用0.25%胰酶(以無鈣鎂離子PBS溶液配制，pH7.4)消化后，加進RPMI-1640培育基(10%重生牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml鏈霉素，pH7.2)吹打細胞，使構成細胞懸液。停止細胞計數，使細胞數為2~2.5×105個/ml。接種于96孔細胞培育板，100μl/孔。接種細胞時須不時動搖細胞懸液，以保障各孔細胞數的平均分歧。96孔板安排于37℃、5%CO2培育箱中培育22h，察看到孔中細胞長滿70~80%。

　　2、在上述RPMI-1640完整培育基中加進放線菌素D，使終濃度為1.5μg/ml，配成樣品濃縮液。取此濃縮液900μl至Eppendorf管中，另在9個5ml管中加進700μl濃縮液。

　　3、用完整培育基將基因工程人腫瘤凋亡素樣品(上海恰爾生物手藝無限公司研制，批號：0304，凍干粉劑，卵白濃度：2mg/支)復溶至1000μl(液體樣品測定卵白濃度后，間接停止下一步支配)，掏出100μl至已裝有900μl濃縮液的Eppendorf管中，充實混勻，盡可能不起泡沫。再今后管中吸出100μl至下一管中，如斯頻頻n次(即測定前10倍濃縮多少次，直到與估量活性相靠近時)。

　　4、從最初濃縮的Eppendorf管中吸出700μl樣品至已裝有700μl濃縮液的5ml管中，充實混勻。再今后管中吸出700μl至下一管一樣裝有700μl濃縮液的5ml管中，如斯頻頻9次(即測定時倍比濃縮樣品)。

　　5、棄往96孔板中舊的培育基，從第一個5ml管中接收已濃縮的樣品100μl至第2排細胞孔中，每一個濃縮度作6復孔(n=6);從第二個5ml管中接收的樣品加進第3排細胞中，依此類推，直至第10排孔竣事。第1排中不含細胞，加進100μl/孔含有放線菌素D的濃縮液作空白對比;第11排加100μl/孔濃縮液作細胞對比;第12排加不含放線菌素D的RPMI-1640完整培育基。

　　6、將加好樣品的96孔板置37℃、5%的CO2培育箱中持續培育22h，顯微鏡下察看細胞形狀變更，開端鑒定成果。

　　7、棄除培育板中的培育基，每孔加進100μl染色液(1.5mmol/L結晶紫)染色30min。洗往染色液，甩往水份并在吸水紙上拍打以使枯燥。沖刷水平以在吸水紙上拍打時，不色彩呈現為好。

　　8、充實枯燥后，每孔加進100μl33%濃度的冰醋酸，在振蕩儀上充實振蕩使結晶消融。設定λ=595nm酶聯檢測儀測定各孔的吸光值，據此數據停止統計學處置，計較出對細胞50%殺傷時所需的基因工程人腫瘤凋亡素的濃度。

　　[活性計較]

　　活性單元界說：在上述測定前提下，以50%SW1990腫瘤細胞被殺傷時，為基因工程人腫瘤凋亡素的1個活性單元。

　　1、樣品的濃縮度取經常利用對數。

　　2、按照對應的細胞毒活性(光密度值)與濃縮度的對數，停止線性回回，獲得計較公式y=ax b，闡發相干系數R值，合適統計學請求者停止下一步闡發。

　　3、代進50%殺傷時的光密度值(即第11排細胞光密度值的一半)，計較出濃縮倍數的對數，再求出濃縮倍數。

　　4、按照原樣品濃度及濃縮倍數計較出基因工程人腫瘤凋亡素對細胞50%殺傷時的濃度，再算出比活性。

　　5、其余細胞的檢測方式同上，計較時按照對SW1990標定的基因工程人腫瘤凋亡素活性單元，先求出對細胞50%殺傷時的所需活性單元，再按照基因工程人腫瘤凋亡素對SW1990細胞殺傷的比活性算出響應的盡對量。

　　[計較成果]

　　0304批原液：比活為：1.03×107活性單元/mg

　　卵白的生物活性及布局測定方式

　　生物活性測定[37,38]是將人胰腺癌1990細胞以2×105個/ml種進96孔細胞培育板，37℃5%CO2培育箱培育4-6小時，用完整培育液(加有1.2μg/m的放線菌素D)做梯度濃縮的樣品加進細胞板(n=3)。置37℃5%CO2培育箱，18h后棄上清，以結晶紫牢固液(結晶紫0.5%，甲醛8%，NaCl0.1%，乙醇20%)染色15min，蒸餾水洗往結晶紫。每孔再加進200μ33%的乙酸，漩渦混勻，置酶聯儀讀出D(595)值，以未加細胞的空白孔為D本底。按照活性單元界說：使培育孔中的細胞50%滅亡為一個單元。

　　MTT法——活性測定

　　1、接種細胞：用0.25%胰卵白酶消化單層培育細胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640培育液配成單個細胞懸液，以每孔103-104個細胞接種于96孔板中，每孔體積200μl。

　　2、培育細胞：將培育板移進CO2培育箱中，在37℃、5%CO2及飽和濕度前提下，培育3-5天。(培育時候取決于嘗試目標和請求)

　　3、呈色：培育第3-5天后，每孔加進MTT溶液(5mg/mL)20μl，37℃，持續孵育4h，停止培育，謹慎吸棄孔內培育液上清。每孔加進150μlDMSO(二甲基亞砜)，振蕩10min，使結晶物充實消融。

　　4、比色：挑選490nm波長，在酶標儀上測定個孔接收值，記實成果。